南京市某地区大气多环芳烃污染及空气微生物多样性相关分析

朱宇琪，吴 昊，热那古力·吾斯曼江，沈梦凡，谈依婷，李 玥，王 丽，吴 倩

南京医科大学公共卫生学院卫生检验与检疫学系，江苏 南京 211166

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbon，PAH）是含有两个或两个以上苯环的碳氢化合物，主要来源于化石燃料、木材等有机物的不完全燃烧，广泛存在于大气、水、土壤等环境中［1］。可通过呼吸、饮食、皮肤接触等多种途径进入人体，也可经胎盘传给婴儿［2］，具有高生物蓄积性、半挥发性和持久性的特点。随着经济的快速发展，特别是城市人口和机动车的迅猛增长，家庭燃煤取暖和汽车尾气排放等因素使得PAH 成为我国城市空气中不容忽视的重点污染物之一［3-5］。长期慢性暴露PAH 会诱发DNA加合物的形成［6］、染色体畸变，可引起成人和儿童肺功能下降，增加慢性阻塞性肺病的发病率和死亡率［7-9］。不同于SO2、NO2、CO、O3、PM2.5和PM10等空气污染物的强制性监测，大气中PAH的含量目前在我国暂无权威官方数据发布。最近有报道称，PAH污染可改变与健康结局相关的共生和环境细菌的种类和丰度，导致微生物种群的失衡，进而危及人体健康［10］。因此，本研究通过分析大气PAH含量与空气微生物种群的相关关系，为评估大气PAH健康风险提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

利用KC-120H 型智能中流量TSP 采样器（青岛崂山电子仪器总厂有限公司），玻璃纤维滤膜采集大气中的颗粒态PAH。利用国产JWL-6 撞击式空气生物粒子采样器（常州康华仪器）进行空气微生物取样测定。

1.2 方法

1.2.1 采样点设置

本研究的观测采样点位于南京市江宁区南京医科大学至诚楼外，采样高度为1 m。该区域远离工厂排放源，距离采样点500 m有双向6车道马路。

1.2.2 采样时间

大气PAH采样时间段为2019年4月16日—6月11日、9月20日—11月15日；2020年5月4日—6月7日、9月27日—11月18日每次采样时间为2 h。同时进行空气微生物采集，采集时间为20 min。

1.2.3 大气颗粒型PAH样品采集

采样方法依据《环境空气质量手工监测技术规范》HJ 194-2017。为保证实验精度，滤膜经干燥箱充分干燥处理。采样流量设为100 L/min。采样结束后，玻璃纤维滤膜用锡纸包裹置于干燥箱避光至少24 h，放入-20 ℃冰箱保存待测。每次采样均设置空白。

1.2.4 大气微生物样品采集

采样依据《公共场所卫生检验方法》GB/T 18204.3-2013 第3 部分：空气微生物。采样皿为普通营养琼脂培养基（蛋白胨10.0 g，牛肉浸出粉3.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂15.0 g/L）。采样流量设为28 L/min。采样结束后，平皿于37 ℃培养48 h，之后用生理盐水冲洗，收集冲洗液，8 000 r/min室温离心5 min，去上清，沉淀于-80 ℃保存待测。

1.2.5 样品检测

大气PAH浓度测定：使用镊子和不锈钢剪刀将滤膜对半剪开，待测样品置于干净的锥形瓶中，加入50 mL 二氯甲烷、40 μL 1 μg/mL 的内标（菲Phed10，屈Chr-d12，Supelco公司，美国），密封超声萃取40 min（80%超声强度），10 mL 上清液移入试管，40 ℃氮气浓缩近干，用200 μL二氯甲烷定容。实验前，所有玻璃仪器须用色谱纯甲醇浸泡，后用色谱纯二氯甲烷润洗。标准曲线的配制：用二氯甲烷稀释20 μg/mL 标准品到100、50、10、5、1 ng/mL（分别加50 μL 1 μg/mL 的内标），上机测定以同位素为内标进行校准。GC-MS 气相色谱-质谱联用仪（TRACE 1310，赛默飞世尔科技公司，美国），色谱柱（DB-5MS，30 m，液膜厚0.25 μm，内径0.25 mm）。升温程序：初始柱温80 ℃，保持2 min，8 ℃/min升至300 ℃，保持此温度10 min。载气：高纯氦气；流速：1.0 mL/min；进样量：2 μL；进样口温度：260 ℃；进样方式：不分流进样。离子源：EI；离子源温度：280 ℃传输线温度280 ℃；扫描方式：SRM扫描。对EPA 16种优控PAH的混合标准溶液（20 μg/mL，Supelco 公司，美国）进行浓度测定：萘Nap、苊烯Any、苊Ana、芴Flu、菲Phe、蒽Ant、荧蒽Fla、芘Pyr、苯并［a］蒽BaA、屈Chr、苯并［b］荧蒽BbF、苯并［k］荧蒽BkF、苯并［a］芘BaP、茚并［1，2，3-cd］芘InP、二苯并［a，h］蒽DBA、苯并［g，h，i］苝BgP。Phe-d10 和Chr-d12 回收率分别为66.8%和123.7%。每次采样时均采用野外空白，将空白滤膜放置于采样器旁，与其他样品处理方法相同，最后扣除空白浓度。13种PAH的仪器检出限在0.02～0.20 ng/mL（其中萘、苊烯和苊回收率不佳，未纳入计算）。

空气微生物多样性分析：根据E.Z.N.A.®soil 试剂盒（Omega Bio-tek 公司，美国）说明书进行总DNA抽提。采用引物（338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对细菌16S rRNA 基因的V3-V4 可变区进行PCR扩增（ABI GeneAmp®9700型）。扩增体系为20 μL：4 μL 5×Fast Pfu 缓冲液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 引物（5 μmol/L），0.4 μL Fast Pfu 聚合酶，10 ng DNA模板。PCR条件如下：95 ℃变性3 min，27次循环（95°C 30s变性，55 ℃30 s退火，72 ℃45 s延伸），最后72 ℃10 min。PCR 产物经回收后纯化。利用Miseq PE300（Illumina 公司，美国）平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。原始测序序列使用Trimmomatic 软件质控，使用FLASH软件进行拼接。使用UPARSE 软件（version 7.1，http：//drive5.com/uparse/），根据97%的相似度对序列进行OTU 聚类；使用UCHIME 软件剔除嵌合体。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 数据库（SSU123），设置比对阈值为70%。数据分析在上海美吉生物医药科技有限公司旗下的免费在线I-Sanger云平台（www.i-sanger.com）上进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件对大气PAH 浓度与空气微生物种群进行Pearson 相关性分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大气PAH浓度分析

分析了2019—2020 年南京某地区大气中13 种PAH的浓度，13种PAH根据芳烃环数不同分为3环（芴Flu、菲Phe、蒽Ant），4 环（荧蒽Fla、芘Pyr、苯并［a］蒽BaA、屈Chr），5环（苯并［b］荧蒽BbF、苯并［k］荧蒽BkF、苯并［a］芘BaP），6 环（二苯并［a，h］蒽DBA、茚并［1，2，3-cd］芘InP、苯并［g，h，i］苝BgP）。采用的收集方法，主要是针对颗粒态PAH，其中萘、苊烯和苊回收率不佳，未纳入计算。大气PAH中菲Phe、荧蒽Fla和芘Pyr占主要成分。2019年秋季大气PAH浓度明显高于春季。2020年春秋两季大气PAH浓度无明显差异（图1A、1B，表1）。

表1 2019年和2020年大气中13种PAH的浓度范围Table 1 The concentration range of 13 PAHs in the atmosphere in 2019 and 2020

图1 2019年和2020年春季与秋季大气PAH浓度Figure 1 Atmospheric PAH concentrations in spring and autumn of 2019 and 2020

2.2 空气中微生物群落组成

2019年与2020年微生物多样性分析可知，在微生物门水平上，2019年和2020年优势菌门均为厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）（图2A、B）。

图2 2019年和2020年大气中微生物门水平上的相对丰度Figure 2 Relative abundance of microbiota in the atmosphere at the phylum level in 2019 and 2020

2019、2020年微生物属水平分析可知，2019年优势菌属为芽胞杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）和微球菌属（Micrococcus）。2020 年则为芽胞杆菌属（Bacillus）和虚构芽胞杆菌属（Fictibacillus）。其中，芽胞杆菌属为2019和2020年共同优势菌属（图3A、3B）。

图3 2019年和2020年空气中微生物属水平上的相对丰度Figure 3 Relative abundance of microbiota in the atmosphere at the genus level in 2019 and 2020

2.3 大气PAH与微生物群落相关性分析

将2019年和2020年的大气PAH浓度分别与微生物属水平进行Pearson 相关分析可知，2019 年在属水平上，芽胞杆菌属（Bacillus）与Fla 和总PAH 呈正相关；微球菌属（Micrococcus）与BbF、BaP、DBA/InP和BgP水平呈正相关（P＜0.05）；土壤芽胞杆菌属（Solibacillus）与Chr和BkF水平呈正相关（P＜0.05）。2020年属水平上，假芽胞杆菌属（Fictibacillus）与BkF水平呈正相关（P＜0.05）；不动杆菌属（Acinetobacter）与Flu的水平呈正相关；鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）与Pyr、BaA和DBA/InP的水平呈正相关（P＜0.05）；考克氏菌属（Kocuria）的丰度与Chr、BbF、BkF 和Pyr 呈正相关（P＜0.05）；节杆菌属（Arthrobacter）的丰度与BaA、Chr和Ant的水平呈正相关。

对2019—2020 年属水平大气微生物与PAH 综合进行相关性分析，类芽胞杆菌属（Paenibacillus）丰度与BkF呈正相关（P＜0.05）；短杆菌属（Curtobacterium）丰度与BaA、Chr 和BaP 呈正相关（P＜0.05）；赖氨酸芽胞杆菌属与Fla、Chr、BbF、BaP、INP/DBA和BgP均呈正相关（P＜0.01）；考克氏菌属（Kocuria）丰度与BbF 呈正相关（P＜0.05）；不动杆菌属（Acinetobacter）与BkF呈正相关；微球菌属（Micrococcus）与土壤芽胞杆菌属（Terribacillus）均与BbF、INP/DBA和BgP呈正相关（P＜0.01）。

3 讨论

大气PAH中2～3环PAH为气态，多存在于气相中，而4 环PAH 为过渡态，在颗粒物和气相中均存在，5～7 环的PAH 多存在固相颗粒物中。本研究主要对大气中颗粒态PAH 进行检测分析。据报道，2001—2002 年南京大气中PAH 的平均水平是62.6 ng/m3［11］，2014 年为18.9 ng/m3［12］。2013 年8 月我国环保部发布实施6 项空气质量检测标准，国家加快推进大气污染防治。本研究中南京大气2019—2020 年春秋两季检测的13 种PAH 总浓度高达21.74 ng/m3。南京大气PAH均以3、4碳环菲、荧蒽及芘为主。2019年大气PAH平均浓度约7.63 ng/m3，而2020年约3.04 ng/m3。这很可能是受疫情时期停工停产的影响，也有可能与本市的亚热带季风气候有关，其中各季风的来源、太阳辐射强度、降水量等都是影响大气PAH浓度的重要因素［13］。本市颗粒物中的PAH来源与北方燃煤污染城市区别较大，而机动车尾气排放导致的PAH 的增加不容忽视［14］。本研究中，在组分上2019 年大气颗粒态PAH 主要是菲Phe、荧蒽Fla、芘Pyr、苯并［g，h，i］苝BgP、屈Chr 和苯并［b］荧蒽BbF。2020 年苯并［g，h，i］苝BgP、屈Chr和苯并［b］荧蒽BbF水平明显降低，而菲Phe、荧蒽Fla、芘Pyr和苯并［a］蒽BaA的水平显著升高。为了更好地响应十九届四中全会精神，南京市该区对产业结构进行较大调整，对高污染企业（化工、燃煤、铸造、瓦砖等）进行较大力度的整治，持续化解经济高速发展与生态环境之间的矛盾，并在空气质量改善方面取得了一定成绩［15］。

本研究在PAH与微生物种群相关分析中发现，厚壁菌门中的芽胞杆菌属和放线菌门中的微球菌属丰度与大气PAH相关。据报道，PAH能够通过干扰共生微生物的内分泌信号通路，对环境和共生菌群产生一定影响［16］。微球菌属是最常见的PAH 降解细菌分离物之一［17-18］。而芽胞杆菌属与大气中多种PAH浓度呈正相关，芽胞菌属具有降解环境中的萘、菲、屈、芘、苯并［a］芘和苯并［a］蒽的作用［19］。研究者从污泥（长期被焦化废水污染）中分离得到1株芽胞杆菌，在单基质及混合基质条件下，蒽、菲、芘均得到了良好的降解［20］。除此之外，相关研究表明大气中的PAH 水平与环境和机体共生菌群之间存在相关性。1 项在芬兰进行的研究也报道了大气PAH 浓度与托儿所空气中的放线菌门及儿童皮肤菌属之间的联系，并进一步分析发现，其中的差异微生物对内分泌代谢具有干扰作用［21］。Sowada 等［22］在上呼吸道咳嗽综合征、慢性阻塞性肺病、哮喘等患者肺部中发现的优势菌群包括厚壁菌门和放线菌门，提示PAH 污染可通过影响微生物多样性与呼吸道免疫性疾病相关。因此，关注PAH 污染引起的健康相关菌群的变化及健康风险，能够为PAH 的健康风险评价提供基础资料，对实施合理的环境干预手段和健康风险评价具有重要指导意义。