MiR-484通过靶向MAPK8抑制人前体脂肪细胞的增殖与分化

仲逢钰，秦振英，李 婧，田 甜，牟雨虹，田慧琴，胡幼芳

南京医科大学第一附属医院儿童保健科，江苏 南京 210029

世界卫生组织报道，自1975 年以来，全球肥胖人数几乎增加了两倍，现共有6 000 万5 岁以下儿童患上肥胖症，肥胖已成为一个严重的公共健康问题［1］。肥胖以脂肪大量堆积为特征，并可导致多种代谢紊乱相关疾病的发生，如2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和心血管疾病［2-3］。脂肪组织不仅是储能器官，为人体的生命活动提供能量，也是人体重要的内分泌器官，可分泌多种细胞因子，具有重要生理功能［4-5］。然而，由于能量摄入与消耗的不平衡，大量能量以甘油三酯的形式储存，脂肪组织迅速膨胀，脂肪组织的扩张将导致炎性细胞因子分泌增加，并减少瘦素和脂联素等抗炎蛋白的分泌，从而导致代谢紊乱［6-7］。因此，深入研究脂肪组织的生成代谢对降低肥胖发生率具有重要意义。

脂肪生成是一个复杂的过程，与多种转录因子的动态表达有关。前体脂肪细胞的增殖和分化增加成熟脂肪细胞的数量，促进了甘油三酯的储存、代谢，并产生脂肪因子［8］。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类内源性非编码单链RNA（18～24核苷酸），通过与靶mRNA的3′非翻译区（3′UTR）特异性结合，在转录后水平负调控基因表达［9］。一些研究表明，miRNA 可能和脂肪细胞的分化增殖发生相关。例如，Chen等［10］发现miR-146b是人内脏前脂肪细胞增殖和分化的调节因子，其表达在人体内发生改变。miR-130b 可以靶向过氧化物酶体增殖物活化受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）抑制猪脂肪沉积［11］。既往研究发现miR-484 在肥胖妇女或儿童的脂肪组织中差异表达［9，12］，同时其表达与组织缺血再灌注损伤［13］、宫颈癌肿瘤发生［14］、肝硬化［15］等有关。然而，miR-484在肥胖中的作用仍不清楚。本研究通过在人前体脂肪细胞（human preadipocytes，HPA）中过表达及沉默miR-484，研究其对HPA细胞增殖及成脂分化的影响，在细胞层面揭示miR-484对肥胖的作用，并探讨了其下游作用的可能靶基因，以期为肥胖的防治提供一个新靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与质粒转染

培养板中按1×105个/mL接种HPA（Science Cell公司，美国），在37 ℃、5%CO2孵箱中，以含5%胎牛血清的人脂肪细胞培养基培养，每2 d换液1次，待细胞贴壁生长至完全融合并接触抑制2 d后（第0天）开始诱导分化。具体步骤为：培养基换用DMEM 高糖培养基，其中含0.5 mmol/L MIX、1 μmol/L地塞米松、5 μg/mL胰岛素和1 μmol/L罗格列酮，培养4 d。随后分化培养基中撤去MIX、地塞米松、罗格列酮，使DMEM高糖培养基中只含有5 μg/mL胰岛素。后每3 d 换液1 次，直至第15 天，约85%以上的细胞已分化为成熟人脂肪细胞。为了评价miR-484对HPA增殖和分化的影响，采用Lipofectamine 3000对细胞转染miR-484 mimic、miR-484 inhibitor、MAPK8 过表达质粒及其阴性对照。

1.2.2 CCK-8实验

为了研究HPA的增殖能力，使用CCK-8检测试剂盒在0 h、24 h、48 h 这3 个不同的时间点进行检测。使用10 μL CCK-8 溶液处理接种在96 孔板中（5×103个/mL）的脂肪细胞，孵育细胞2 h 后，使用分光光度仪测定其450 nm处吸光度值。

1.2.3 油红O染色

油红O 染色在室温下进行，取诱导分化成熟的人脂肪细胞（第15 天），用PBS 洗涤细胞3 次，后在10%多聚甲醛中固定1 h，吸取出固定液后晾干。油红O 溶解于异丙醇中，配成3 mg/mL的染液并过滤，随后加入晾干的细胞中染色1 h。最后，用PBS轻轻洗涤细胞，倒置显微镜观察，镜下脂滴应成亮红色。

1.2.4 细胞甘油三酯含量测定

细胞接种于6 孔板中，取分化成熟的人脂肪细胞（第15 天），PBS 轻柔洗涤细胞1 次后用胰酶消化细胞，收集细胞于离心管中，根据甘油三酯测定试剂盒说明书，加入100 μL裂解液，室温裂解10 min，留取20 μL 裂解液进行BCA 法蛋白定量，70 μL 裂解液70 ℃加热10 min后离心取上清，使用分光光度仪在510 nm处测量细胞裂解物中甘油三酯的含量，测定结果用总蛋白浓度校准。

1.2.5 靶基因测定与验证

（2）辅助材料成本。报废的动力电池需要用酸、碱、有机溶剂、沉淀剂等进行处理，回收的工艺不同以及最后产品的不同，所使用的辅助材料也有所不同。

利用在线数据库Targetscan7.2（http：//www.targetscan.org/vert_72/）对miR-484 的靶基因及潜在的结合位点进行了预测。使用DAVID 6.7在线数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行基因本体（Gene Ontology，GO）分析、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析。为了验证结合位点，构建了荧光素酶报告质粒MAPK8 的野生型和突变型。将293T 细胞接种到24 孔板中，以含10%胎牛血清的DMEM 培养基培养。当细胞密度达到70%时，将野生型或突变型质粒与miR-484 mimic 及miR-484 mimic NC 共转染到293T 细胞中。24 h 后使用双荧光素酶报告分析试剂盒测量荧光素酶活性。

1.2.6 RT-qPCR检测

使用TRIzol法提取细胞的总RNA，使用TaKaRa反转录试剂盒进行mRNA 和miRNA 的逆转录，用SYBR Premix Ex Taq试剂盒（TaKaRa）进行定量实时聚合酶链反应。使用2-ΔΔCT法计算mRNA和miRNA的相对表达水平。β-actin用作mRNA的内部标准化对照，U6用作miRNA的内部标准化对照。qRT-PCR检测中使用的引物序列见表1。

表1 实时定量PCR目的基因的引物Table 1 The sequences of the primers for RT-qPCR

1.2.7 Western blot实验

用RIPA法提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度后加入上样缓冲液，将蛋白样品的浓度定为20 ng/mL，在100 ℃金属浴煮沸10 min 变性。采用10%SDS/PAGE 凝胶和聚偏氟乙烯膜分离及转移蛋白，将膜在室温下用5%牛奶封闭1 h后，与适当稀释的特异性抗体（MAPK8、β-actin）一起4 ℃孵育过夜，TBST洗涤膜3 次，然后加入二抗，在摇床中孵育1 h。最后用超敏ECL化学发光试剂检测曝光蛋白条带。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。定量资料以均数±标准差（）表示，3组独立样本之间的差异采用重复测量方差分析检验，当3 组独立样本间的差异有统计学意义时，SNK 法进行组间两两比较。采用Graphpad Prism 绘制直条图、复式直条图、线图等。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-484 在HPA 分化过程中的表达及其过表达验证

为了验证HPA 分化过程中miR-484 的表达情况，分别取分化第0天、第4天、第8天、第15天的细胞，使用RT-qPCR 技术检测，结果与未分化的细胞（第0 天）相比，随着分化的进行，miR-484 表达量逐渐降低（P＜0.05），表明miR-484可能参与HPA的分化（图1A）。此外，为了验证miR-484过表达体系的建立，在HPA中转染了miR-484及其空白质粒，通过RT-qPCR发现miR-484表达较对照组及mimic NC组增高（P＜0.05，图1B）。

图1 miR-484在HPA分化过程中的表达及其过表达验证Figure 1 Relative expression of miR-484 in HPA and overexpression validation of miR-484

2.2 过表达miR-484抑制HPA增殖分化

为了进一步了解过表达miR-484对脂肪生成的作用，将miR-484 mimic及miR-484 mimic NC分别转染至HPA 中。CCK-8 实验检测转染后0 h、24 h 及48 h HPA的增殖能力，发现与对照组及mimic NC组相比，miR-484 mimic组在24 h及48 h的吸光度值降低（P＜0.05，图2A）。同时对细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin D3 和CDK4 的mRNA 相对表达量进行了检测，RT-qPCR 实验发现miR-484 mimic 组的细胞周期相关基因表达量均减少（P＜0.05，图2B），由此可见，过表达miR-484可以抑制HPA的增殖。

为了研究miR-484 对HPA 成脂分化的影响，在HPA中过表达miR-484后，对分化第15天的成熟人脂肪细胞进行油红O染色，镜下观察发现，与对照组及mimic NC 组相比，miR-484 mimic 组脂肪细胞脂滴数量及体积明显减少（图2C），也对脂肪分化相关基因PPAR γ、C/EBP α和FABP4 的mRNA 相对表达量进行了检测，RT-qPCR 实验发现miR-484 mimic组的脂肪分化相关基因表达量均减少（P＜0.05，图2D）。同时，甘油三酯定量测定发现与对照组及mimic NC组相比，miR-484 mimic组的甘油三酯含量减少（P＜0.05，图2E）。这表明过表达miR-484可以抑制HPA向成熟脂肪细胞分化。

图2 miR-484抑制HPA的增殖分化Figure 2 miR-484 inhibits HPA proliferation and differentiation

2.3 沉默miR-484促进HPA的增殖分化

为了进一步了解沉默miR-484对脂肪生成的作用，将miR-484 inhibitor及miR-484 inhibitor NC分别转染至HPA中。CCK-8实验检测转染后0 h、24 h及48 h HPA的增殖能力发现，与对照组及inhibitor NC组相比，miR-484 inhibitor组在24 h及48 h的吸光值升高（P＜0.05，图3A）。同时对细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin D3 和CDK4 的mRNA 相对表达量进行了检测，RT-qPCR实验发现miR-484 inhibitor组的增殖相关基因表达量均升高（P＜0.05，图3B），由此可见，沉默miR-484可以促进HPA的增殖。

为了研究沉默miR-484 对HPA 成脂分化的影响，在脂肪细胞中沉默miR-484 后，对分化第15 天的成熟人脂肪细胞进行油红O染色，镜下观察发现，与对照组及inhibitor NC组相比，miR-484 inhibitor组脂肪细胞脂滴数量及体积增加（图3C），也对脂肪分化相关基因PPAR γ、C/EBP α和FABP 4的mRNA相对表达量进行了检测，RT-qPCR 实验发现miR-484 inhibitor 组的脂肪分化相关基因表达量均升高（P＜0.05，图3D）。同时甘油三酯定量测定发现与对照组及inhibitor NC组相比，miR-484 inhibitor组的甘油三酯含量增加（图3E，P＜0.05）。这表明沉默miR-484可以促进HPA向成熟脂肪细胞分化。

图3 沉默miR-484促进HPA的增殖分化Figure 3 miR-484 inhibitor promotes HPA proliferation and differentiation

2.4 miR-484靶向作用于MAPK8

miRNA 可以与mRNA 的3′UTR 区结合沉默靶基因的表达，从而发挥重要的生物学功能。通过在线生物信息学分析预测发现，MAPK8 可作为miR-484的靶基因（图4A）。为了进一步验证miR-484 是否可与MAPK8 的3′UTR 区结合，本研究构建了MAPK8 的突变型（MAPK MUT）与野生型（MAPK WT）质粒，并进行了双荧光素酶报告基因分析，结果表明，与mimic NC 组相比，miR-484 mimic 与MAPK8 WT 共转组的相对荧光活性降低（图4B，P＜0.05），表明miR-484可与野生型MAPK8结合，由此可见，MAPK8可以与miR-484结合，可作为miR-484的靶基因。

图4 miR-484 靶向作用于MAPK8Figure 4 miR-484 targets MAPK8

2.5 miR-484抑制MAPK8的mRNA及其蛋白表达

为了进一步验证miR-48对其靶基因MAPK8的作用，本研究在脂肪细胞中过表达miR-484，qRT-PCR和蛋白免疫印迹检测结果显示，与对照组及mimic NC 组相比，过表达miR-484 显著下调了脂肪细胞中MAPK8 的mRNA 和 蛋 白 水 平（图5，P＜0.05）。这表明miR-484可以抑制MAPK8的表达。

图5 miR-484抑制MAPK8的mRNA及其蛋白表达Figure 5 The expression of MAPK8 was down-regulated by miR-484

2.6 过表达MAPK8部分挽救miR-484对HPA增殖分化的抑制作用

为了进一步研究miR-484 是否确实通过其靶标MAPK8 发挥功能，本研究将miR-484 mimic 与MAPK8 mimic 质粒共转染进HPA 细胞。通过CCK-8实验检测转染后0 h、24 h及48 h HPA细胞的增殖能力发现，与miR-484 mimic 相比，共转染组24 h 及48 h 吸光度升高（P＜0.05，图6A）。对细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin D3和CDK4的mRNA相对表达量进行检测，发现MAPK8 与miR-484 共转部分逆转了miR-484引起的相关基因表达量的下降（P＜0.05，图6B）。由此可见，MAPK8 可以逆转miR-484抑制HPA细胞增殖的作用。对分化第15天的成熟人脂肪细胞进行油红O染色，镜下观察发现，MAPK8 逆转了过表达miR-484 引起的脂肪细胞脂滴数量及体积的减少（图6C），对脂肪分化相关基因PPAR γ、C/EBP α和FABP 4的mRNA 相对表达量进行检测，发现MAPK8 可以逆转miR-484 引起的脂肪分化相关基因表达量的下降（P＜0.05，图6D）。甘油三酯定量测定，发现MAPK8 逆转了过表达miR-484 引起的甘油三酯含量下降（图6E，P＜0.05）。这表明过表达MAPK8 可以逆转miR-484 抑制HPA增殖分化的作用。

图6 过表达MAPK8部分挽救miR-484对HPA增殖分化的抑制作用Figure 6 Overexpression of MAPK8 partially rescued the function of miR-484 on HPA proliferation and differentiation

3 讨论

miRNA是调节基因表达的非编码小RNA，在不同组织或器官中都发挥重要作用，它在脂肪组织中的主要功能是调节脂肪细胞的增殖、分化、代谢和内分泌［16］。大量研究表明，肥胖与miRNA 的失调密切相关，miRNA表达的改变可能导致控制一系列生物功能的基因表达模式的改变，包括炎症、胰岛素敏感性和脂肪生成［17］。miR-484差异表达于肥胖人群，但是miR-484 对脂肪细胞的生物学功能的影响尚不清楚。本研究发现miR-484在HPA分化过程中表达逐渐降低，暗示了miR-484可能与肥胖发生相关，同时也可能是脂肪分化与形成过程的重要靶点。

抑制脂肪组织的脂肪生成是肥胖发生过程中的一个中心事件，而脂肪细胞增殖和分化是脂肪组织中脂质积累的基础，可由多种因素调节［18］。控制脂肪的分化及增殖可以抑制肥胖和肥胖相关疾病的发生。本研究表明miR-484与HPA细胞的增殖及细胞周期调节基因Cyclin D1、Cyclin D3 和CDK4 表达成负相关。细胞周期蛋白（Cyclin D1、Cyclin D3）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK4）被认为是真核生物中细胞生长和增殖的关键调节因子，这是哺乳动物细胞中G1/S和G2/M转变所必需的。Liu等［19］研究表明miR-484通过靶向CCL-18抑制胃癌细胞的增殖。Xie等［20］发现lncRNA ZFAS1 通过沉默miR-484来促进结肠癌细胞的增殖。这些研究与本研究结果相一致。同时，本研究也发现miR-484 与脂肪分化基因PPARγ、C/EBPα 和FABP4 表达呈负相关。PPARγ和C/EBPα是脂肪分化过程中发挥核心作用的转录因子，FABP4 促进脂肪酸增溶、运输和新陈代谢。本研究进一步对HPA 进行了油红O染色和甘油三酯检测，发现miR-484 与脂滴生成负相关。因此认为miR-484 可以调控脂肪细胞的分化和增殖。

本研究中也对miR-484抑制HPA增殖与分化的机制进行了探讨。miRNA 是内源性小RNA，通过与蛋白质编码基因的mRNA 配对来指导其转录后抑制，从而发挥重要的基因调节作用。通过在线生信分析发现MAPK8可能是miR-484的靶基因，并通过双荧光素酶报告实验确认了miR-484 与MAPK8具有相应的结合位点，同时过表达miR-484 可以抑制MAPK8的表达。MAPK8 是蛋白丝裂激酶家族的成员，充当多种生物化学信号的集成点，如胰岛素信号通路，并且涉及各种细胞过程，例如增殖、分化、转录调控和发育［21-22］。Osawa 等［23］发现MAPK8与胰岛素抵抗相关，MAPK8 活性在肥胖的胰岛素抵抗小鼠中增加，而敲除MAPK8的小鼠显示肥胖减少和胰岛素敏感性提高。本研究过表达MAPK8，发现其可以逆转过表达miR-484抑制HPA细胞增殖及分化的作用。结合既往研究及本研究结果，MAPK8可能是miR-484的靶基因。

综上所述，本研究发现miR-484在HPA分化过程中低表达，并通过进一步的功能实验，证实了miR-484抑制HPA 的增殖与分化，该作用可能是通过靶向MAPK8 来实现。本研究也存在一些缺点，例如miR-484 预测的相关靶基因较多，我们只关注了MAPK8，因为其属于胰岛素信号通路，且相关研究表明其与肥胖相关，后期仍需采取转录组学等手段进一步研究相关机制。因此，本研究结果提示miR-484在肥胖中发挥关键作用，miR-484可能是肥胖诊断与治疗的一个靶点。