枯草芽孢杆菌Czk1挥发物混合活性组分对橡胶灵芝菌的抑菌机理

梁艳琼，李锐，吴伟怀，习金根，谭施北，黄兴，陆英，贺春萍，易克贤

（中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室，海口 571101）

红根病是危害严重的世界性橡胶树根部病害，在我国热区各个植胶区内普遍发生[1]。其病原菌为橡胶灵芝菌[Ganodermapseudoferreum(Wakef.)Over.et Steinm]，具有潜伏期长、寄主范围广、在土壤中蔓延迅速和防治困难的特点，是限制我国橡胶单产提高的重要生物因子，近年来危害愈加严重[2-4]。当前生产上主要采用十三吗啉灌根防治，其价格昂贵，且长期使用导致病菌产生抗性，从而防效下降[5]，因此，迫切需要开发新的防治途径。生物防治因具有环境友好、对非靶标生物安全的特点而越来越受到重视。研究表明，微生物源挥发性物质具有抑制病原菌的效果[6-8]。挥发性物质（volatile organic compounds，VOCs）是一类小分子、易挥发的有机或无机化合物，在一定温度和压力条件下挥发后能防治有害生物，避免了二次污染，在抑菌、杀虫及除草等方面都得到广泛应用。Zheng等[9]报道，短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）TB09和苏云金杆菌（B.thuringiensi）TB72产生的挥发性物质2-壬酮、2-苯乙胺、甲基辛基甲酮对炭疽病菌（Colletotrichumgloeosporiodes）具有强抑制作用。Zhang等[10]研究发现，绿针假单胞菌金色亚种（Pseudomonaschlororaphissubsp.aureofaciens）SPS-4挥发性物质异戊醇、苯乙醇和2-甲基丁醇对甘薯块根黑腐病菌（Ceratocystis fimbriata）具有较好的抑制作用。Wu等[11]报道，白色链霉菌（Streptomycesalbulus）NJZJSA2挥发性物质4-甲氧基苯乙烯、2-戊基呋喃和茴香醚具有抗真菌活性。刘元元等[12]研究发现，芽孢杆菌（Bacillusspp.)X4和N4产生的挥发性物质2-甲基丁酸、3-甲基丁酸和异丁酸对棉花黄萎菌（Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum）有抑菌活性。

枯草芽孢杆菌Czk1菌株由本课题组分离自橡胶树根部，其挥发性物质对橡胶树红根病菌（G.pseudoferreum）、褐根病菌（Phellinusnoxius）、紫根病菌（Helicobasidiumcompactum）、白根病菌（Rigidopruslignosus）、臭根病菌（Sphaerostilbe repens）和炭疽病菌（C.gloeosporiodes）具有较好的抑制作用[13]；同时，该菌株产生的苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基对甲酚具有较好的抑菌作用；挥发物混合活性物质质量浓度为25 μg·mL-1时，对橡胶灵芝菌抑制率为67.07%，当质量浓度为100 μg·mL-1时，其抑制率为87.21%[14]。然而，Czk1挥发物混合活性组分作用机理尚未明确。为了探讨Czk1菌株挥发性物质对橡胶灵芝菌的抑制机理，拓宽对真菌互作机制的认识，在挥发性物质苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基对甲酚混合组分作用于橡胶灵芝菌后，通过测定菌丝细胞中糖类、蛋白物质、DNA和关键代谢酶活性的变化，寻找混合活性组分对橡胶灵芝菌的抑制途径，从而为新型农药的研制与橡胶树根病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 培养基及供试病原菌 LB培养基：胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 5 g、蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

PDA培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

PDB培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

供试病原菌：橡胶树红根病菌GP030由本课题组分离、鉴定和保存。

1.1.2 试验药剂 99.50%苯甲醛、98.00%2,6-二叔丁基对甲酚和DMF（用于溶解2,6-二叔丁基对甲酚、3,5-二甲氧基苯乙酮）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；98.00%3,5-二甲氧基苯乙酮购自百灵威科技有限公司。挥发性组分苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基对甲酚按照GC-MS的测定结果（苯甲醛：3,5-二甲氧基苯乙酮：2,6-二叔丁基对甲酚=7:8:1）人工合成[14]。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞内容物泄露情况测定 设置4个处理：处理 1（T1）为质量浓度 25 μg·mL-1挥发物活性组分，处理2（T2）为100 μg·mL-1挥发物活性组分，对照组为DMF和清水。将橡胶灵芝菌接入二分格培养皿一侧，28℃培养8 d后，在另一侧培养皿放入挥发物混合活性组分，在0、12、24、36、48、60 h时取样，用5 mL无菌水清洗菌体，12 000 r·min-1离心2 min，用紫外分光光度计（SPECORD 200 PLUS，德国耶拿）测定各处理组的OD260值。试验重复3次。

1.2.2 橡胶灵芝菌糖含量和蛋白质含量检测 参照陈毓荃[15]和黄蓉等[16]方法，将橡胶灵芝菌新鲜菌块接入PDB培养基中，28 ℃、180 r·min-1震荡培养7 d，滤出菌丝，无菌水冲洗后分装到另一批PDB三角瓶中。处理组瓶子上空放入浓度为25、100 μg·mL-1挥发物混合活性组分无菌滤纸（30 mm）后迅速封口，对照组不加入挥发物活性组分。各处理均在28 ℃、180 r·min-1条件下培养，8 d 后过滤菌丝，用无菌水洗涤后，烘干称重备用。称取等量上述不同处理的橡胶灵芝菌菌丝，采用葡萄糖溶液滴定法分别测定各处理橡胶灵芝菌的总糖含量和还原糖含量；制作蛋白标准曲线，采用双缩脲法测定不同处理的橡胶灵芝菌菌丝蛋白质含量[15]。试验重复3次。

1.2.3 橡胶灵芝菌苹果酸脱氢酶、几丁质酶活性测定 采用苹果酸脱氢酶试剂盒和几丁质酶试剂盒（上海臻科生物科技有限公司）测定橡胶灵芝菌的苹果酸脱氢酶、几丁质酶活性。

取培养7 d的处理组和对照组菌丝体各1 g，液氮研磨破碎后，加入6 mL HEPES缓冲液（4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液）浸提10 min，4℃、14 000 r·min-1离心20 min，取上清夜依照试剂盒步骤测定苹果酸脱氢酶活性。

称取处理组和对照组的菌丝体各0.3 g，液氮研磨，加入5 mL预冷的提取缓冲液，4℃、14 000 r·min-1离心30 min，保留上清液，按照几丁质酶试剂盒步骤测定其活性。

1.2.4 橡胶灵芝菌丙二醛含量测定 利用丙二醛检测试剂盒（TBA比色法）测定橡胶灵芝菌的丙二醛含量。在二分格培养皿含PDA培养基的一侧接入橡胶灵芝菌，培养8 d后，在另一侧接入挥发物混合活性组分，分别于1、3、5和7 d时收集各处理菌丝，用磷酸缓冲液（pH 7.0）洗涤3次，4℃离心收集菌丝体。称取0.1 g湿菌丝，加入液氮，冰浴下研磨至匀浆，依照试剂盒步骤测定丙二醛的含量。试验重复3次。

1.2.5 DNA孵育测定 将橡胶灵芝菌接入二分格培养皿一侧含PDA的平板中间，在二分格培养皿另一侧分别加入25和100 μg·mL-1的挥发物活性组分，于28℃培养15 d后收集菌丝，采用OMEGA真菌DNA提取试剂盒提取橡胶灵芝菌的DNA，以不加挥发物活性组分为对照处理。试验重复3次，琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 挥发物混合活性组分对橡胶灵芝菌细胞内容物泄露情况的影响

从图1可以看出，清水和DMF对照组在整个实验过程中吸光值变化不大，一直保持在0.1～0.2范围内，整体趋于平稳的趋势；不同质量浓度的挥发物混合活性组分处理后，随着处理时间的延长，橡胶灵芝菌细胞内容物泄露（吸光度值）不断增加，T1和T2两个处理之间差异显著（P＜0.01），T2处理60 h时达到了0.999，而T1处理在60 h时为0.788，细胞内容物的泄漏量随着挥发物混合活性组分质量浓度的增大而增大。表明处理组的细胞内溶物泄漏明显，且不同质量浓度对橡胶灵芝菌细胞内容物泄露情况的影响不同。

图1 挥发物混合活性组分处理后橡胶灵芝菌细胞内容物泄露情况Fig.1 Cellular content leakage of G.pseudoferreum after treated with volatilized active components

2.2 挥发物混合活性组分对橡胶灵芝菌糖类含量的影响

由图2可知，橡胶灵芝菌菌丝体中的还原糖含量随挥发物混合活性组分质量浓度升高而降低。DMF和清水对照处理中橡胶灵芝菌菌丝体中的还原糖含量分别为4.12%和4.33%，两对照组差异不显著。T1和T2处理组的还原糖含量分别下降为3.12%和2.36%，两处理组差异显著（P＜0.01），且均与对照组差异极显著（P＜0.01）。由此可见，一定质量浓度的挥发物混合活性组分可降低橡胶灵芝菌还原糖含量，T2处理的糖含量更低，表明高质量浓度挥发物混合活性组分可显著影响橡胶灵芝菌还原糖含量。

DMF和清水对照组的总糖含量分别为30.12%和31.45%，T1和T2处理的总糖含量分别为27.45%和20.23%，与对照组相比，总糖含量分别下降了10.83%和34.29%，与对照组差异显著（P＜0.01），且不同质量浓度两处理间差异显著。总之，橡胶灵芝菌总糖含量呈现随挥发物混合活性组分质量浓度升高而降低的变化趋势。

2.3 挥发物混合活性组分对橡胶灵芝菌和蛋白质含量的影响

经挥发物混合活性组分处理后，橡胶灵芝菌菌丝蛋白质含量随着处理质量浓度的增大而减少，且比对照组含量降低。T1处理蛋白质含量为49.12 μg·mL-1，DMF、清水对照处理的蛋白质含量分别为53.22和51.88 μg·mL-1，其与对照组无显著差异，说明低质量浓度挥发物混合活性组分对橡胶灵芝菌菌丝中蛋白质的合成无显著影响；T2处理的蛋白质含量为43.25 μg·mL-1，显著低于对照组（P＜0.01）（图3）。由此可知，高质量浓度的挥发物混合活性组分影响橡胶灵芝菌蛋白质的合成。

图3 挥发物混合活性组分处理后橡胶灵芝菌蛋白含量变化Fig.3 Protein content of G.pseudoferreum after treated with volatilized active components

2.4 挥发物混合活性组分对苹果酸脱氢酶、几丁质酶活性的影响

由图4可知，T1和T2处理苹果酸脱氢酶活性分别是 0.209 和 0.183 U·g-1·min-1，差异极显著（P＜0.01），随着挥发物混合活性组分质量浓度增大，橡胶灵芝菌苹果酸脱氢酶的活性降低。DMF和清水对照的苹果酸脱氢酶活性分别为0.248和0.256 U·g-1·min-1，两对照组差异不显著，处理组和对照组差异极显著（P＜0.01），说明挥发物混合活性组分对橡胶灵芝菌苹果酸脱氢酶活性影响较大，可能是通过影响细胞三梭酸循环，从而引起代谢途径的变化。

图4 挥发物混合活性组分处理后橡胶灵芝菌苹果酸脱氢酶和几丁质酶的含量Fig.4 Activity of malate dehydrogenase and chitinase of G.pseudoferreum after treated with volatilized active components

经挥发物混合活性组分处理后，橡胶灵芝菌几丁质酶活性降低，且挥发物混合活性组分质量浓度越高，活性降低越明显。当挥发物混合活性组分质量浓度为25 μg·mL-1（T1）时，几丁质酶活性 为 4.736 U·g-1·s-1，质量浓度为100 μg·mL-1（T2）时，活性降低至4.06 U·g-1·s-1，两处理间差异达极显著（P＜0.01）。DMF和清水对照的几丁质酶活性较高，但两者间差异不显著，处理组和对照组差异达到极显著（P＜0.01）。上述结果表明，挥发物混合活性组分可显著影响几丁质酶的活性，从而影响能量代谢的关键作用。

2.5 挥发物混合活性组分对橡胶灵芝菌细胞中丙二醛含量的影响

由图5可知，DMF和清水对照在0～7 d内，丙二醛含量变化不明显，且随着时间的延长，丙二醛含量平稳。T1和T2处理呈现缓慢上升的趋势，在第5天达到最大值，分别为116.45和85.56 mmol·g-1，显著高于对照组（P＜0.01），且随着处理质量浓度的增大和时间的延长，丙二醛含量增加，两个处理间差异极显著（P＜0.01）。

图5 挥发物混合活性组分处理后橡胶灵芝菌的丙二醛含量Fig.5 Malondialdehyde content of G.pseudoferreum after treated with volatilized active components

2.6 挥发物混合活性组分对橡胶灵芝菌DNA的影响

由图6可知，不同质量浓度的挥发物混合活性组分，其DNA条带不一样，随着质量浓度的增大，DNA条带随之减弱，表明DNA含量降低。挥发物混合活性组分处理的基因组DNA的分子量没有明显改变，说明挥发物混合活性组分并未破坏橡胶灵芝菌的一级结构。

图6 挥发物混合活性组分处理后橡胶灵芝菌的DNAFig.6 DNA of G.pseudoferreum after treated with volatilized active components

3 讨论

微生物的细胞膜可以控制细胞内、外营养物质和代谢产物的运送，维持细胞的正常生命活动，同时能够协助抵抗外源物质侵入，在遭受外界破坏后，细胞膜发生变化，内部电解质、糖类、蛋白质等生物大分子发生泄露[17]。真菌细胞膜是活性物质作用的靶位，活性物质能改变菌丝体细胞膜的稳定性，导致其结构受损，内含物外渗，从而达到抑菌效果[18]。阮元等[19]报道，小麦赤霉菌细胞结构受到盐酸小檗碱破坏胞内物质外渗,从而造成可溶性蛋白质含量增高。芦慧等[20]研究发现，链霉菌702菌株所产抗真菌单体组分DZP8可使水稻纹枯病菌细胞可溶性糖和蛋白质渗漏。曾志红等[21]报道，丁香乙醇提取物导致枝孢霉菌(Cladosporiumsp.)电导率上升、菌丝可溶性蛋白质含量增加。董玉鹏等[22]发现，绿叶挥发性物质反式-2-己烯醛可严重破坏梨果黑斑病菌（Alternariaalternata）细胞膜的完整性，膜电导率和核酸渗出率显著增加。本研究发现，当挥发性活性物质作用于橡胶灵芝菌后，菌丝中总糖随挥发物混合活性组分质量浓度的升高而降低，一定浓度的挥发组分可降低橡胶灵芝菌还原糖含量，与阮元等[19]、芦慧等[20]报道基本一致。高质量浓度的挥发物混合活性组分影响橡胶灵芝菌蛋白质的合成，低质量浓度的无显著影响，这一结果与曾志红等[21]报道蛋白质含量增加有些不同，可能是不同物质作用靶标不一样，且作用对象不同，其结果也不一样。本研究中丙二醛含量随着处理质量浓度的增大和处理时间的延长而增大，其含量增加反映了菌丝细胞膜结构受损害的程度。这些结果说明，当真菌细胞受到挥发物混合活性组分的作用时，细胞膜为了应对新的环境会对其组分进行调整，如内溶物的释放、丙二醛含量等。这一过程的发生是基于细胞膜的损坏，而且随着挥发物混合活性组分的质量浓度升高，细胞受损情况加重，表明挥发物混合活性组分能够破坏细菌的细胞膜从而达到抑菌效果。

苹果脱氢酶是柠檬酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸，也可催化胞浆中草酰乙酸形成苹果酸。苹果脱氢酶还参与细胞多种生理活动，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、抗病性以及抗病过程中的活性氧代谢等[23]。苹果脱氢酶活性能反映细胞代谢是否正常，袁勇军等[24]报道，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)Y-6产抗菌肽可降低桃软腐菌(Rhizopusstolonifer)琥珀酸脱氢酶和苹果脱氢酶的活性,抑制桃软腐菌的呼吸代谢或利用营养物质酶的生物合成。陈玉环等[25]研究表明，桂枝主要抑菌活性物质肉桂醛和肉桂酸能显著降低意大利青霉菌(Penicilliumitalicum)的苹果酸脱氢酶活性，从而使细胞能量代谢活动无法正常进行，或使细胞死亡。几丁质是真菌细胞壁的重要结构物质，其合成和水解代谢影响着细胞壁的功能。邢介帅等[26]研究发现，枯草芽孢杆菌所产生的蛋白酶对棉花枯萎病菌菌丝生长具有抑制作用,推测可能是蛋白酶降解了棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporumf）细胞壁中的蛋白质，造成细胞壁缺损，在膨胀压的作用下菌体发生变形。本研究发现，当挥发物混合活性组分作用于橡胶灵芝菌后，显著影响细胞苹果酸脱氢酶、几丁质酶活性，与前面报道的基本一致[24-26]。不同的是，上述报道仅是某种物质作用从而使某个关键酶失去活性，而挥发物混合活性组分是由不同活性物质混合组成的，其作用靶标不同，可同时侵入细胞，使细胞壁和细胞膜受损。细胞表面受到不同程度的损坏，随着挥发混合活性组分质量浓度和作用时间的增加，细胞通透性增强，内溶物流出后进入细胞内部，影响生命大分子物质蛋白质和核酸的合成，使细胞功能受损，生长和增殖受到抑制，从而改变代谢途径。

本研究发现，苯甲醛、3,5-二甲氧基苯乙酮、2,6-二叔丁基对甲酚挥发混合活性组分可有效抑制橡胶灵芝菌，造成糖类、蛋白质物质的减少从而影响细胞的稳定；同时，能较好抑制能量代谢相关酶（苹果酸脱氢酶、几丁质酶）活性，使能量代谢过程受阻。挥发混合活性物质的抑菌机理可能主要是通过破坏细胞膜结构、扰乱代谢活动来实现的。本研究仅是在细胞水平上研究混合活性物质作用机理，关于挥发性活性物质的更多作用机制还需深入研究。