MAPKs信号通路抑制剂对红耳龟渗透压调节基因表达的影响

卢英楠，袁悦，孔雨晨，吉欣宇，史海涛，洪美玲，丁利

(热带岛屿生态学教育部重点实验室，海南省热带动植物生态学重点实验室，海口571158)

红耳龟自20世纪 80年代引入我国以来，对本地龟类的生存与繁殖造成了严重的威胁(Kai & Shi，2017)。该物种原生活在湖泊、沼泽、池塘、小溪等植被丰富的淡水环境中(Swingland & Gibbons，1991)，但国内外研究发现红耳龟还可在咸水环境中生存(Morin，1990)。杨江波(2014)野外调查发现，红耳龟可在海南南渡江(盐度5.3‰～14.6‰)的半咸水环境中生存，幼体也可在半咸水附近的沙滩孵出；室内模拟实验也表明，红耳龟在盐度低于15‰的水环境中可存活 3个月以上(Hong.，2014)；环境中盐度的改变可显著影响动物渗透压调节(Brocker.，2012)，红耳龟可通过离子和非离子的转运进行渗透压调节以应对环境盐度的增加(Hong.，2014)，但红耳龟适应盐度环境的渗透压调节机制尚不清楚。

目前关于MAPKs信号通路是否参与龟类的渗透压调节以及是否对渗透压调节基因产生影响等尚不清楚。本研究将3种抑制剂(JNK、ERK、p38MAPK)作用于红耳龟，并对其进行盐度胁迫处理，探究MAPKs抑制剂对渗透压调节相关基因mRNA转录水平的影响，以期了解红耳龟在适应半咸水过程中MAPKs信号通路对渗透压的调节作用。

1 材料和方法

1.1 试验动物和饲养条件

红耳龟购自海口泓旺农业养殖有限公司。试验在海南师范大学生命科学学院龟鳖养殖室进行。试验前，将体型较统一、活力好、健康的幼龄个体(体质量120.37 g±10.25 g)驯养2周以适应养殖室环境。驯养期间1周喂食2次，并于喂食后24 h更换养殖水体，养殖水体pH7.45±0.26，溶解氧含量8.40 mg·L±0.31 mg·L。驯养结束后，分为淡水组(对照组)、淡水+MAPKs抑制剂(不同浓度)组、5‰盐度组、5‰盐度+MAPKs抑制剂(不同浓度)组，每组8只，组间体质量无显著性差异，试验期间停止喂食。

1.2 主要试剂

JNK抑制剂(SP600125)(货号：S1876)、MEK1/2抑制剂(U0126)(货号：S1901)、p38MAPK抑制剂(SB203580)(货号：S1863)、二甲基亚砜(DMSO)(货号：ST038)均购自上海碧云天生物技术有限公司。Genious 2× SYBR Green Fast qPCR Mix(货号：RK21204)购自ABclonal Technology Co.，Ltd.。PrimerScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 试验方法

将红耳龟随机分为8组，每组8只：淡水组、淡水+JNK抑制剂组(SP600125浓度：5 mg·kg、15 mg·kg、25 mg·kg)、5‰盐度组、5‰盐度+JNK抑制剂组(SP600125浓度：5 mg·kg、15 mg·kg、25 mg·kg)。SP600125使用DMSO溶解后腹腔注射，同时给淡水组和5‰盐度组的腹腔注射相同体积(0.2 mL)的DMSO。

将红耳龟随机分为8组，每组8只：淡水组、淡水+MEK1/2抑制剂组(U0126浓度：1 mg·kg、5 mg·kg、10 mg·kg)、5‰盐度组、5‰盐度+MEK1/2抑制剂组(U0126浓度：1 mg·kg、5 mg·kg、10 mg·kg)。U0126使用DMSO溶解后腹腔注射，同时给淡水组和5‰盐度组的腹腔注射相同体积(0.2 mL)的DMSO。

将红耳龟随机分为8组，每组8只：淡水组、淡水+p38MAPK抑制剂组(SB203580浓度：5 mg·kg、15 mg·kg、25 mg·kg)、5‰盐度组、5‰盐度+p38MAPK抑制剂组(SB203580浓度：5 mg·kg、15 mg·kg、25 mg·kg)。SB203580使用DMSO溶解后腹腔注射，同时向淡水组和5‰盐度组的腹腔注射相同体积(0.2 mL)的DMSO。

1.4 盐度处理及样品采集

抑制剂处理后，将红耳龟置于淡水和5‰盐度水环境中24 h，麻醉后处死，取肾脏组织，-80 ℃保存。

1.5 总RNA的提取和反转录

常规Trizol法提取样品总RNA，微量核酸蛋白定量仪NanoDropTMOne/OneC检测总RNA浓度和纯度。以1 μg的总RNA为模板进行反转录，反转录体系及条件参照PrimerScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书。

1.6 实时荧光定量PCR

通过GenBank和实验室红耳龟转录组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE117354)确定基因序列，运用Primer-BLAST进行引物设计(表1)。以内参基因β-actin为参照进行实时荧光定量PCR分析，反应体系参照Genious 2× SYBR Green Fast qPCR Mix试剂盒说明书，反应条件为：95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环;运用2法分析AQP3、HSP70、SMIT、SGK1、AR的mRNA相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物信息

1.7 统计与分析

2 结果

2.1 MAPKs抑制剂对AQP3基因表达水平的影响

与淡水组相比，5‰盐度组AQP3 mRNA相对表达量显著升高(<0.05)，淡水+不同浓度的JNK、ERK、p38MAPK抑制剂组中，AQP3 mRNA相对表达量无显著变化(>0.05)。但5‰盐度+不同浓度的ERK、p38MAPK抑制剂组中，AQP3 mRNA相对表达量均显著下调，与5‰盐度组之间的差异显著(<0.05)，但不同浓度的ERK、p38MAPK抑制剂组间AQP3 mRNA相对表达量无显著差异(>0.05)。5‰盐度+不同浓度的JNK抑制剂组中，AQP3 mRNA相对表达量的组间差异不显著(>0.05；图1)。

图1 MAPKs抑制剂对AQP3 mRNA相对表达量的影响

2.2 MAPKs抑制剂对HSP70 mRNA基因表达水平的影响

与淡水组相比，5‰盐度组的HSP70 mRNA相对表达量显著升高(<0.05)。在淡水+JNK、ERK、p38MAPK抑制剂各组中，HSP70 mRNA相对表达量无显著变化(>0.05)。5‰盐度+JNK、ERK、p38MAPK抑制剂各组中，3种抑制剂均下调了HSP70 mRNA相对表达量，与5‰盐度组之间的差异显著(<0.05)，且在JNK、ERK、p38MAPK抑制剂浓度分别为5 mg·kg、1 mg·kg、25 mg·kg时，HSP70 mRNA相对表达量最低(图2)。

图2 MAPKs抑制剂对HSP70 mRNA相对表达量的影响

2.3 MAPKs抑制剂对AR mRNA基因表达水平的影响

与淡水组相比，5‰盐度组的AR mRNA相对表达量显著升高(<0.05)。在淡水+JNK、ERK、p38MAPK抑制剂各组中，AR mRNA相对表达量无显著变化(>0.05)。5‰盐度+JNK、ERK、p38MAPK抑制剂各组中，JNK抑制剂浓度为15 mg·kg时，AR mRNA相对表达量较5‰盐度组显著下调(<0.05)，浓度为5 mg·kg、25 mg·kg时的AR mRNA相对表达量与5‰盐度组之间的差异不显著(>0.05)；ERK抑制剂浓度为 5 mg·kg、10 mg·kg时，AR mRNA相对表达量比5‰盐度组显著下调(<0.05)；p38MAPK抑制剂浓度为5 mg·kg、15 mg·kg时，AR mRNA相对表达量比5‰盐度组显著降低(<0.05；图3)。

图3 MAPKs抑制剂对AR mRNA相对表达量的影响

2.4 MAPKs抑制剂对SGK1基因表达水平的影响

与淡水组相比，5‰盐度组的SGK1 mRNA相对表达量显著升高(<0.05)。在5‰盐度+JNK、ERK、p38MAPK抑制剂各组中，随着p38MAPK抑制剂浓度的增加，SGK1 mRNA相对表达量呈下降趋势，且在浓度为25 mg·kg时，SGK1 mRNA相对表达量最低(<0.05)；随ERK抑制剂浓度增加，SGK1 mRNA相对表达量虽表现出下降的趋势，但各组间差异不显著(>0.05)；JNK抑制剂组与5‰盐度组的SGK1 mRNA相对表达量之间差异不显著(>0.05)(图4)。

图4 MAPKs抑制剂对SGK1 mRNA相对表达量的影响

2.5 MAPKs抑制剂对SMIT基因表达水平的影响

与淡水组相比，5‰盐度组的SMIT mRNA相对表达量显著升高(<0.05)。在5‰盐度+抑制剂各组中，JNK、p38MAPK抑制剂组中SMIT mRNA相对表达量均下调，与5‰盐度组相比差异显著(<0.05)；ERK抑制剂组与5‰盐度组相比，SMIT mRNA相对表达量无显著变化(>0.05；图5)。

图5 MAPKs抑制剂对SMIT mRNA相对表达量的影响

3 讨论

盐度是影响水生生物生存的重要环境因子，外界环境中的盐度急剧升高时，会造成机体细胞失水、离子浓度增加、DNA损伤、细胞骨架重排、转录和翻译受到抑制等问题，为了使细胞在高渗下维持正常功能和稳态，机体进化出一系列机制(Dmitrieva & Burg，1998；Burg.，2007)。通过激活高渗响应信号MAPKs通路以适应高盐环境，本研究发现，MAPKs信号通路抑制剂显著降低了AQP3、SGK1、SMIT、HSP70等的表达，说明MAPKs信号调控的渗透压调节基因在红耳龟入侵半咸水环境中起到了一定的保护作用。

MAPKs是从酵母到人类高度保守的信号蛋白，在高渗条件下，MAPKs可迅速激活，并发挥多种功能，在渗透胁迫信号传导中起关键作用，如调节细胞体积以及下游渗透压调节基因的表达等(Kültz & Burg，1998；de Nadal.，2002；de Hoffmann.，2009)。在MAPKs众多调控基因中，AQP3作为传统的选择性水通道蛋白，参与水的分泌、吸收及细胞膜内外平衡调节(李金库等，2021)，高渗条件下SGK1在维持体内Na、K稳态中发挥重要作用(Kaneko.，1990；Arteaga，2005；Flores.，2005；Aoi.，2006),AR和SMIT通过积累有机渗透物质山梨醇和肌醇等参与高渗条件下的渗透调节(Bagnasco.，1987；Miyakawa.，1999)，而HSP70的高表达可减少高渗对细胞的损害(Yang.，2009)等，以上渗透压调节基因在机体应对高渗胁迫、维持细胞稳态中均发挥重要作用。而MAPKs作为其上游调控因子可以直接或者间接对其进行调控。如在高渗环境中阻断p38MAPK可以抑制HSP70的转录水平(Sheikh-Hamad.，1998)；高盐生长环境诱发DNA损伤，p53被活化，促进ERK1/2的磷酸化，磷酸化ERK1/2诱导SGK1的高表达(You.，2004)；阻断狗肾脏细胞p38MAPK活性可以抑制高渗条件下的钠/肌醇转运(Bissonnette.，2008)；高渗条件下在人视网膜色素上皮细胞中加入ERK、p38MAPK抑制剂会显著抑制AR的表达(Winges.，2016)；AQP3缺失小鼠的p38、JNK和ERK磷酸化水平显著下降(Lei.，2017)等。本研究也发现，红耳龟在进入盐度环境后，相关的渗透压调节基因表达显著上调，在应用特异性抑制剂阻断MAPKs信号通路后，其中，ERK、p38MAPK抑制剂可显著降低AQP3、AR mRNA相对表达量，3种抑制剂均可显著降低HSP70 mRNA的相对表达量，而SGK1的表达水平主要受p38MAPK抑制剂的调控，JNK、p38MAPK抑制剂可以显著降低SMIT mRNA相对表达量，且随着JNK抑制剂浓度的升高，抑制效果加强。结合试验结果，推测外来淡水物种红耳龟入侵半咸水环境过程中，在响应高渗胁迫初期，可能通过提高渗透压调节因子SGK1表达，促使Na快速进入细胞，并通过AQP3吸水来恢复细胞体积，在适应高渗压力下的离子跨膜运输中发挥作用。此外，为了克服高渗带来的不利影响，有机渗透物质可能成为红耳龟在应对高渗环境下的保护剂，依靠转运蛋白积累包括肌醇和山梨糖醇来平衡渗透性变化(Ho，2006；Alfieri & Petronini，2007)。HSP70高渗条件下的合成水平增加，则是用来修复或降解细胞内变性蛋白质，从而提高肾脏组织对渗透压剧烈变化的适应能力(Yang & Feige，1992)。而MAPKs信号通路参与了上述渗透压相关基因的调控过程，并通过提高渗透压调节基因的转录水平以抵消外界盐度变化引起的渗透压不平衡所造成的破坏性后果。但MAPKs信号通路作用是错综复杂的，不只1条支路对渗透压保护基因有调节作用，多是两者或三者共同参与渗透压调节(崔文晓，2020)。p38MAPK作为红耳龟响应高渗应激的重要感知途径，在调节下游渗透压保护基因AQP3、HSP70、AR、SGK1、SMIT的表达中发挥着不可替代的作用。

4 结论

红耳龟在入侵半咸水环境后，会通过提高AQP3、HSP70、AR、SMIT、SGK1等渗透压调节基因mRNA的转录水平以抵御外界的不良影响。MAPKs信号通路抑制剂显著降低了相关渗透压调节基因的表达，说明MAPKs信号通路参与了红耳龟在适应半咸水过程中的渗透压调节过程。