miR-495-3p靶向IL-6R抑制宫颈癌细胞的增殖和转移的机制研究

吉 洁 马志君 曹振东 邵雪斋 张玉娟（承德医学院附属医院，承德 067000）

宫颈癌发病率、病死率在女性生殖系统肿瘤均居首位［1］。据统计，全球每年宫颈癌新发病例高达50 万例，占所有新发癌症病例的5%，其中约85%发生在医疗资源相对匮乏的发展中国家［2］。尽管宫颈癌的预防、诊断和治疗方法不断改善，但晚期宫颈癌患者的预后仍然不佳，许多患者在手术切除、规范化的放化疗后仍复发和转移［3］。因此，研究宫颈癌的发生、转移的生物学机制具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是由20～25 个核苷酸组成的单链小分子RNA，其通过与靶基因的3'非翻译区（untranslated region，UTR）结合来调控转录后基因表达。此外，miRNA 还可作为癌基因或抑癌基因，通过特定的靶点或信号通路参与胚胎发育、细胞分化、凋亡、耐药性、肿瘤转移等多种生物学过程［4-5］。近年研究显示，miR-584 等miRNA 在宫颈癌中异常表达，表明miRNA 可能作为宫颈癌新的预后标志物或治疗靶点［6］。miR-495-3p 是近年发现的抑癌基因，miR-495-3p 低表达与胃癌、透明细胞肾细胞癌的增殖和转移有关［7-8］。然而，miR-495-3p 在宫颈癌中的生物学作用尚未可知。miRNA 预测网站显示白细胞介素6 受体（interleukin 6 receptor，IL-6R）基因是miR-495-3p 的潜在靶基因。既往研究表明胃癌细胞中IL-6R 表达上调，IL-6R 高表达与临床病理特征之间具有显著的相关性［9］。IL-6R 高表达还可促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移能力［10］。因此，本研究以IL-6R 为切入点，探讨miR-495-3p 在宫颈癌细胞增殖和转移中的作用，以期为宫颈癌临床诊疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 材料 人宫颈永生化细胞H8、宫颈癌细胞SiHa、HeLa、caski 购自中国科学院上海细胞库；RPMI1640、MEM、DMEM培养基购自美国Gibco公司；RNeasy Mini Kits、第一链cDNA 合成试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix 购自大连TaKaRa 公司；Lipo⁃fectamine 2000、Taqman miRNA 逆转录试剂盒购自美国Invitrogen 公司；细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit 8，CCK-8）、细胞裂解液、聚偏氟乙烯膜购自上海碧云天公司；鼠源IL-6R 抗体、兔源细胞周期素D1（CyclinD1）、兔源基质金属蛋白酶2（matrix metallo⁃proteinase，MMP2）、MMP9 购自上海艾博抗公司；康宁Transwell 小室购自北京优尼康生物公司；miR-495-3p模拟物（miR-495-3p mimics）及其阴性对照（miR-NC）、IL-6R 小干扰RNA（si-IL-6R）及其阴性对照（si-NC）、IL-6R 过表达质粒（pcDNA-IL-6R）及其阴性对照（pcDNA-NC）、野生型/突变型IL-6R 荧光素酶报告基因载体（WT/MUT-IL-6R）由上海吉玛制药公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 H8、SiHa、HeLa、caski细胞采用RPMI1640、MEM、DMEM 培养基在37℃、5%CO2的细胞培养箱进行培养。培养基中均补充10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素。当细胞密度达80%时，按 照1∶3 比例进 行传代，2～3 d 换液1次。

1.2.2 RT-qPCR 检 测miR-495-3p 和IL-6R mRNA表达 利用RNeasy Mini Kits从H8、HeLa、caski各组SiHa细胞中分离总RNA。使用Taqman miRNA 逆转录试剂盒将miRNA转化为cDNA，使用第一链cDNA合成试剂盒将mRNA 逆转录为cDNA。使用引物和SYBR Green PCR Master Mix 进 行RT-qPCR 扩 增。2-ΔΔCt法分析miR-495-3p（内参为U6）、IL-6R mRNA（内参为β-actin）的表达水平。miR-495-3p 正向引物序列5'-GCGGAAACAAACATGGTGCA-3'，反向引物序列5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6 正向引物序列5'-ACAGATCTGTCGGTGTGGCAC-3'，反 向引物序列5'-GGCCCCGGATTATCCGACATTC-3'；IL-6R 正向引物序列5'-AGTGTCGGGAGCAAGTTCAG-3'，反向引物序列5'-TGGTCTGTGGAGAGA⁃AGCCT-3'；β-actin 正向引物序列5'-CCAACCGC⁃GAGAAGATGA-3'，反向引物序列5'-CCAGAGGCG⁃TACAGGGATAG-3'。

1.2.3 转染和实验分组 在细胞转染前1天，将生长良好的SiHa细胞接种到6孔无血清培养基中。按照Lipofectamine2000 使用说明，当细胞融合度达到60%时进行转染。将1 μl 的Lipofectamine2000 与24 μl无血清培养基混合。将50 pmol的待转染物与适量无血清培养基混合，使总体积为25 μl。室温下混合20 min。然后将混合物加入每个孔中进行培养。6 h 后更换培养基。根据转染物不同分为miRNC 组、miR-495-3p 组、si-NC 组、si-IL-6R 组、miR-495-3p+pcDNA-NC组、miR-495-3p+pcDNA-IL-6R组。

1.2.4 CCK-8 实验检测细胞活力 将各组SiHa 细胞接种于96孔板，接种后48 h进行CCK-8测定。每孔添加10 μl CCK-8试剂，将培养板在培养箱内孵育2 h。空白孔调零，采用酶标仪检测450 nm 波长处吸光度（absorbance，A）值，计算细胞增殖率。细胞增殖率（%）=（A实验组/A对照组）×100%。

1.2.5 Transwell实验检测细胞转移能力 转染48 h，消化细胞并悬浮在无血清培养基中。细胞密度调整为2×106个/ml。将Transwell 小室放置在24 孔板中。在上室和下室分别加入200 μl的细胞悬浮液和500 μl 的含有10%胎牛血清的培养基。细胞培养24 h 后，擦去上室内细胞，用4%多聚甲醛固定细胞15 min，用结晶紫染色15 min。显微镜下随机选择5个视野进行细胞计数，其均值为转移细胞数。

1.2.6 Western blot 检测IL-6R、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达 使用放射免疫沉淀分析裂解缓冲液提取细胞蛋白，并分析蛋白样品浓度。利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后转移到聚偏氟乙烯膜上。5%脱脂牛奶封闭膜后，在4℃条件下与适当的一抗孵育过夜。然后，用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育膜。以β-actin 为内参，利用增强型化学发光检测试剂盒进行显色，凝胶成像系统检测目的蛋白灰度值，以目的蛋白和β-actin灰度值比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.2.7 双荧光素酶报告实验 合成含有与miR-495-3p 结合位点或结合位点突变序列的IL-6R 野生型序列（5'-UUCAAGUUUUUGUUUGUUUGUUU-3'）或突变型序列（5'-UUCAAGUUUUUGUUGUCA⁃CUGAU-3'），将其克隆到pmirGIO 双荧光素酶表达载体，分别命名为WT-IL-6R、MUT-IL-6R。利用Lipofectamine2000 将WT-IL-6R、MUT-IL-6R 分别与miR-495-3p mimics、miR-NC 共转染SiHa 细胞，48 h后，双荧光素酶报告检测系检测各组细胞相对荧光素酶活性。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0软件进行统计分析，所有实验均重复3 次，进行3 次独立实验，数据以表示。采用t检验评估两组间差异；采用单因素方差分析评估多组间差异，进一步两组间比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在宫颈癌细胞系miR-495-3p 和IL-6R 表达情况 与人宫颈永生化细胞H8 比较，宫颈癌细胞SiHa、HeLa、caski 中miR-495-3p 的表达降低，IL-6R mRNA和IL-6R蛋白的表达升高（P＜0.05，图1）。

图1 在宫颈癌细胞系中miR-495-3p和IL-6R表达情况Fig.1 Expressions of miR-495-3p and IL-6R in cervical cancer cell lines

2.2 过表达miR-495-3p 对宫颈癌细胞SiHa 增殖和转移的影响 与miR-NC 组比较，miR-495-3p 组SiHa 细胞miR-495-3p 的表达显著升高，CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表达显著降低，细胞增殖率、转移数降低（P＜0.05，图2）。

图2 过表达miR-495-3p 对宫颈癌细胞SiHa 增殖和转移的影响Fig.2 Effect of overexpression of miR-495-3p on prolifera⁃tion and metastasis of cervical cancer cells SiHa

2.3 干扰IL-6R 表达对宫颈癌细胞SiHa 增殖和转移的影响 与si-NC 组比较，si-IL-6R 组SiHa 细胞IL-6R 蛋白表达显著降低，CyclinD1、MMP2 和MMP9蛋白表达显著降低，细胞增殖率、转移数降低（P＜0.05，图3）。

图3 过表达IL-6R对宫颈癌细胞SiHa增殖和转移的影响Fig.3 Effects of overexpression of IL-6R on proliferation and metastasis of cervical cancer cells SiHa

2.4 miR-495-3p 靶向IL-6R Starbase 软件在线预测显示，miR-495-3p 与IL-6R 之间存在部分连续和互补的核苷酸序列，见图4A。与miR-NC 和WT-IL-6R 共转染组比较，miR-495-3p 和WT-IL-6R 共转染组SiHa 细胞荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；而miR-495-3p 和MUT-IL-6R 共转染组SiHa 细胞荧光素酶活较miR-NC 和MUT-IL-6R 共转染组无显著变化，见图4B。miR-495-3p 组SiHa 细胞IL-6R 蛋白表达较miR-NC 组显著降低；anti-miR-495-3p 组SiHa细胞IL-6R 蛋白表达较anti-miR-NC 组显著升高（P＜0.05，图4C、D）。

图4 miR-495-3p靶向调控IL-6R表达Fig.4 miR-495-3p targeted and regulates expression of IL-6R

2.5 过表达IL-6R 可以逆转miR-495-3p 对SiHa 增殖和转移的影响 与miR-495-3p+pcDNA-NC 组比较，miR-495-3p+pcDNA-IL-6R 组SiHa 细胞IL-6R、CyclinD1、MMP2、MMP9 表达增加，细胞增殖率、转移数增加（P＜0.05，图5）。

图5 过表达IL-6R 可以逆转miR-495-3p 对SiHa 增殖和转移的影响Fig.5 Overexpression of IL-6R could reverse effects of miR-495-3p on SiHa proliferation and metastasis

3 讨论

宫颈癌的发生发展是一个多基因参与、多步骤的复杂过程。早期宫颈癌患者预后较好，而晚期宫颈腺癌由于局部复发和转移扩散，治疗几乎无效［3］。因此，探讨miR-495-3p 在宫颈癌细胞增殖和转移中的作用，对开发新的治疗策略，改善宫颈癌患者生存现状意义重大。

近年来，miRNA 已成为肿瘤研究的热点，尤其是在恶性肿瘤中。研究显示miR-495-3p 在结肠癌中表达下调，上调miR-495-3p 可诱导结肠癌细胞凋亡，抑制细胞周期进展［11］。miR-495-3p 在黑色素瘤中表达显著降低，上调miR-495-3p 通过靶向E2F3可降低黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力［12］。此外，miR-495-3p 低表达还与胃癌细胞的增殖、侵袭、自噬以及多药耐药有关［13-14］。与上述研究结论一致，本研究发现宫颈癌细胞中miR-495-3p 表达较宫颈永生化细胞H8 显著降低，提示miR-495-3p 表达异常可能与宫颈癌发生有关。进一步功能分析显示，过表达miR-495-3p后SiHa细胞的增殖和转移能力显著降低，促增殖蛋白CyclinD1、促转移蛋白MMP2 和MMP9 表达显著降低。以上研究表明miR-495-3p低表达可促进宫颈癌细胞的增殖和转移。

IL-6R 在多种人类疾病中的作用已被报道。BHARTI 等［15］研究发现临床高侵袭性乳腺导管癌中IL-6R表达增加，下调IL-6R表达可增加单胺氧化酶A活性，抑制肿瘤血管生成和侵袭。WANG 等［16］报道miR-21 通过靶向IL-6R 可抑制内皮祖细胞的增殖、迁移和侵袭，靶向miR-21/IL-6R 通路有助于降低癌症患者复杂静脉血栓形成，促进血栓的溶解。JIANG 等［17］指出IL-6R 高表达是胶质瘤患者生存不良的预测因子，下调IL-6R 可抑制细胞的增殖、侵袭和神经球的形成，抑制体内肿瘤的发生。邢兵等［18］研究表明，BRMS1 可抑制IL-6R 表达进而降低鼻咽癌细胞的增殖和转移能力。此外，IL-6R 高表达还与上皮性卵巢癌的化疗耐药有关［19］。本研究发现宫颈癌细胞中IL-6R 表达显著增加，与miR-495-3p表达呈负相关。双荧光素酶报告基因证实IL-6R 是miR-495-3p 的靶基因。在SiHa 细胞中过表达miR-495-3p 可抑制IL-6R 表达，抑制miR-495-3p 则促进IL-6R 表达。更重要的是抑制IL-6R 表达可降低CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表达水平以及SiHa细胞的增殖和转移能力，而恢复实验显示过表达IL-6R 则逆转miR-495-3p mimics 对SiHa 细胞增殖、转移及其相关蛋白表达的影响。以上结果表明，miR-495-3p 低表达通过靶向IL-6R 可促进宫颈癌进展。

综上所述，本研究发现宫颈癌细胞中miR-495-3p表达降低，过表达miR-495-3p 通过靶向IL-6R 可抑制宫颈癌细胞的增殖和转移能力。因此，上调miR-495-3p 可抑制宫颈癌的发展，为宫颈癌的靶向治疗提供了新的策略。