羊口疮病毒ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期、凋亡及免疫细胞因子的影响

王宪军，向 华，张旭梅，任玉鹏，朱江江

(1.西南民族大学 畜牧兽医学院，四川 成都 610041；2.青藏高原动物遗传资源保护与利用 四川省重点实验室，四川 成都 610041)

羊口疮是由口疮病毒(Orfvirus，ORFV)引起的以病羊口唇、鼻等部位形成水泡、脓疱或痂皮等特征的人兽共患传染病，主要侵害山羊、绵羊等小反刍兽[1-2]。羊口疮的流行不仅影响畜牧业的发展，也严重威胁着人类的健康[3]。当前主要通过接种疫苗的方式来控制ORFV的感染。然而，目前尚无商品化的疫苗来预防该疾病的发生。羊口疮反复暴发的现状已成为制约养羊产业发展的瓶颈和重要的公共卫生问题。假如能够通过对ORFV诱导机体免疫反应的分子机制研究从而推动羊口疮靶向药物的研发，将从根本上解决目前羊口疮治标不治本的现状。因此，ORFV诱导机体免疫反应的分子机制研究成为急需解决的关键科学问题，对于推动养羊产业的健康发展和保障人类人身安全具有重要的理论价值和现实意义。

ORFV属于痘病毒科副痘病毒属，是一种双链DNA病毒[4-5]。ORFV基因组全长138 kb，G+C含量高达63%～64%[6]。ORFV基因组在其末端都有一个反向重复序列，且末端基因是可变区，常常与毒力、免疫调节和发病机制等有关[7]。细胞因子是由免疫细胞(比如T细胞、B细胞、巨噬细胞等)和某些非免疫细胞(如内皮细胞、表皮细胞等)经刺激而合成和分泌的一类高活性的小分子蛋白质。ORFV的感染过程中，宿主细胞可释放大量的细胞因子(如 IL-6、IL-8、TNF-α 等)参与免疫炎症反应，ORFV自身也能够产生抗炎蛋白来逃避宿主免疫反应。如黄忍等[8]研究发现，作为ORFV编码的末端129蛋白可抑制山羊睾丸细胞内免疫效应分子IL-1β、IL-6和IFN-γ的表达。ORFV 121蛋白可通过与细胞质NF-κB-p65 相互作用，抑制p65 Ser536磷酸化和核转运，从而阻止免疫相关基因的转录和翻译[9]。由此可见，宿主的免疫系统在机体抗ORFV过程中发挥着重要的作用[10]。同时，朱晓琴等[11]、罗杰等[12]发现，IL-6、IL-1β和IL-8可促进体外培养的星形胶质细胞和大鼠动脉平滑肌细胞的增殖。INF-γ可明显地抑制人骨肉瘤细胞株增殖现象[13]。由此可见，细胞因子的分泌在反应宿主细胞对抗病毒的免疫应答效应的同时，推测其对细胞周期也产生一定的影响。然而细胞周期和细胞凋亡密切相关，细胞增殖现象的表现也一定程度上反映细胞凋亡的水平[14]。ORFV118是羊口疮病毒基因组末端变异区的一片段，目前对其研究主要为ORFV118作为一种免疫原性蛋白，可以通过刺激机体发生免疫应答，进而局部产生强烈的炎症反应[15]，而对其细胞周期、凋亡及诱导机体发生免疫应答的机制目前仍不清楚。

本研究旨在克隆羊口疮病毒ORFV118基因并对其进行生物信息学分析；随后将构建的表达载体pEGFP-ORFV118转染山羊睾丸支持细胞，利用实时荧光定量检测技术分析ORFV118蛋白对机体免疫应答相关的4种细胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ及TNF-α)表达水平的影响，同时检测ORFV118蛋白对细胞周期及凋亡的作用，研究结果可为进一步研究ORFV118在诱导机体免疫应答及全面揭示该蛋白的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 毒株、细胞和载体

羊口疮病毒JYY-ORFV株为由西南民族大学动物医学实验室分离、鉴定保存；pEGFP-NI载体和山羊睾丸支持细胞由本实验室保存；DH5α为宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.2 主要试剂及仪器

PremixTaq、T4DNA连接酶、DL2000 DNA Marker、SYBR®Premix ExTaqTM(2×)均购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒、pMD19-T载体购自OMEGA公司；Hind Ⅲ、BamH Ⅰ为上海玉博生物公司产品； DMEM培养基和胎牛血清均为Gibco公司产品；青霉素-链霉素购自Hyclone公司；Lipofectamine 3000转染试剂盒购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；TRIzol、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒、QuantStudio3购自美国Thermo Fisher Scientific公司；细胞周期及凋亡检测试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司；山羊IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α ELISA检测试剂盒购自睿信生物公司；流式细胞仪购自日本SYSMEX公司；荧光倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司；氯仿、异丙醇、DEPC等其他试剂均为国产试剂。

1.3 ORFV118基因的克隆鉴定及真核重组表达载体的构建

参照GenBank登录的ORFV SY17株的基因组序列(登录号：MG 712417.1)，Primier Primer 5软件设计1对特异性引物为P1：5′-CGGGATCCATGTCATTTCAACGGGGCA-3′；P2：5′-CCAAGCTTTTAGCGGGAGTAGCCGTC-3′。以提取的羊口疮病毒的DNA为模板，扩增ORFV118基因。PCR反应体系(25 μL)为200 ng/μL DNA模板1 μL，10 μmol/L Pre mixTaq 12.5 μL，10 μmol/LP1和P2引物各1 μL，ddH2O补足。反应条件如下：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性 30 s，60 ℃退火 25 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃最后延伸7 min。PCR产物经2%的TAE琼脂糖凝胶电泳检测。检测条带正确后进行胶回收，并将其连接至pMD19-T载体，转化DH5α，经菌落PCR和测序鉴定后质粒命名为pMD19-ORFV118。

构建真核表达载体pEGFP-ORFV118选择Hind Ⅲ和BamH Ⅰ限制性内切酶，亚克隆引物如下，上游引物5′-AAGCTTATGTCATTTCAACGGGGCAA-3′(划线部分为HindⅢ酶切位点)；下游引物5′-GGATCCTTAGCAGGAGTAGCCGTCAC-3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点)。以质粒pMD19-ORFV118为模板，亚克隆引物扩增，将扩增的片段连接到载体pEGFP-N1并转化，双酶切及测序正确后保存，构建真核表达载体pEGFP-ORFV118。

1.4 ORFV118基因的生物信息学分析

使用ProtParam在线软件分析ORFV118基因的理化性质；SignalP 4.1分析信号肽；Protscale分析疏水性；TMHMM Server v.2.0分析蛋白跨膜结构域；SOPMA和SWISS-MODEL分别进行二、三级结构分析；采用NetNGlyc 1.0和NetPhos 3.1分别预测ORFV118蛋白N糖基化位点和磷酸化位点；在线软件WOLF进行蛋白亚细胞定位预测。

1.5 山羊睾丸原代细胞的复苏及pEGFP-ORFV118重组质粒的转染

将本实验室保存的第6代山羊睾丸细胞复苏至6孔板[16]，细胞汇合度达70%～90%，按照脂质体转染法将质粒pEGFP-ORFV118转染至细胞，并以空载体pEGFP-N1为阴性对照，以正常生长的细胞为空白对照。转染48 h后，提取细胞总RNA，检测转录动力学，具体步骤参考文献[8]。

1.6 检测ORFV118蛋白在山羊睾丸原代细胞中的蛋白表达

按照1.5步骤操作，转染48 h后，按照蛋白提取试剂盒说明书收集细胞总蛋白，以鼠抗GFP抗体(1∶500)为一抗，HRP-兔抗鼠IgG(1∶10 000)为二抗，通过Western Blot检测ORFV118蛋白的蛋白表达水平。试验共设置2组，分别为pEGFP-ORFV118转染组、pEGFP-N1空载转染组，且每组3个重复。

1.7 ORFV118蛋白对睾丸支持细胞4种细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ)表达水平的影响

参照1.5的步骤，转染前0 h和转染后48 h，分别收集细胞RNA样和细胞上清液，用RT-qPCR和ELISA检测细胞内外的IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α表达情况，RT-qPCR引物见表1。反应体系(20 μL)为：SYBR®Premix ExTaqTM10 μL，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，100 ng/μL的模板1 μL，ROX 0.2 μL，ddH2O补足。反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，同步采集荧光信号，72 ℃ 30 s，一共35个循环，熔解曲线：95 ℃变性15 s，60 ℃冷却1 min，使DNA双链充分结合，最后从60 ℃逐步加热至95 ℃，每一步增加0.15 ℃并保持1 s，同时采集荧光信号。以GAPDH为参比基因，每个待测样本设置3个重复。细胞上清液参考ELISA试剂盒说明书检测ORFV118对睾丸支持细胞上清中IL-1β和IFN-γ的分泌情况。

表1 细胞因子的引物序列表1 Primer sequences of cytokine

1.8 ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期及周期相关基因的影响

参照1.5的步骤，转染后48 h收集细胞，PBS洗涤2次，95%乙醇固定过夜，1 000 r/min离心5 min，弃掉上清液，向细胞中加入400 μL碘化丙啶染色液，吹打混匀，37 ℃避光30 min，用流式细胞仪进行检测。根据GenBank公布的山羊周期相关基因CDK2和牛的P21序列，设计引物，引物序列见表2。RT-qPCR检测周期相关基因的mRNA表达水平(UXT为内参基因)。RT-qPCR反应体系和条件同1.7。

1.9 ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞凋亡及凋亡相关基因的影响

参照1.5的步骤，转染后48 h收集细胞，PBS洗涤2次，使用Binding Buffer缓冲液重悬细胞，加入5 μL Annexin V/FITC，室温避光5 min，再加入10 μL碘化丙锭溶液(PI)，并加400 μL PBS，立刻进行流式检测。根据GenBank 公布的山羊凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase7序列以及牛凋亡相关基因p53、BCL2L11序列设计引物，引物序列见表2。RT-qPCR检测凋亡相关基因的mRNA表达水平(UXT为内参基因)。RT-qPCR反应体系和条件同1.7。

表2 细胞周期及凋亡相关基因的引物序列Tab.2 Primers sequences of cell cycle and apoptosis-related genes

1.10 数据统计与分析

运用2-ΔΔCT方法分析ORFV118蛋白对4种细胞因子mRNA水平的影响，其中ΔCt=Ct细胞因子-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt细胞因子48 h-ΔCt细胞因子0 h。计算结果在SPSS 22.0中进行单因素方差分析和显著性检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。分析ORFV118蛋白对周期或凋亡相关基因的mRNA水平时，采用2-ΔΔCT方法进行分析，其中ΔCt=Ct周期或凋亡相关基因-CtUXT。并将计算结果在SPSS 22.0中进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 ORFV118基因的PCR扩增、克隆鉴定

成功扩增ORFV118基因，琼脂糖凝胶电泳可检测与预期大小相符的片段(图1-A)。克隆转化后，菌落PCR检测显示，与预期的ORFV118基因的大小相符(图1-B)。

A.ORFV118基因PCR扩增； B.质粒pMD19T-ORFV118的PCR扩增。M.2 000 bp DNA ladder；P.阳性对照；N.阴性对照；1.ORFV118基因。图4同。

2.2 ORFV118基因的生物信息学分析

生物信息学分析结果显示，ORFV118基因309 bp，共编码102个氨基酸。分子质量为11.58 ku；蛋白呈亲水性(图2-A)，无信号肽(图2-B)，为不稳定的非分泌性蛋白；同时，无保守结构域(图 2-C)和跨膜结构域(图2-D)；二级结构显示(图2-E)，α螺旋占17.65%，β螺旋占2.94%，无规卷曲为68.63%，延伸链为10.78%。三级结构结果如图2-F。在第7，87位氨基酸处有2个N糖基化位点(图2-G)；ORFV118蛋白有11个丝氨酸、2个苏氨酸和3个酪氨酸磷酸化位点(图2-H)。亚细胞定位显示，该蛋白主要定位于细胞核(图2-I)。

A.ORFV118蛋白的疏水性分析；B.ORFV118蛋白的信号肽预测；C.ORFV118蛋白的跨膜结构域分析；D.ORFV118蛋白的保守结构域预测；E.ORFV118蛋白的二级结构预测；F.ORFV118蛋白的三级结构预测；G.ORFV118蛋白的糖基化位点预测；H.ORFV118蛋白的磷酸化位点预测；I.ORFV118蛋白的亚细胞定位分析。

2.3 ORFV118基因真核重组表达载体的构建及鉴定

真核表达载体pEGFP-ORFV118经Hind Ⅲ、BamH Ⅰ双酶切后电泳鉴定获得的目的基因与预期条带大小相符(图3)，表明构建的质粒正确。

M.5000 DNA Ladder；1.pEGFP-ORFV118的Hind Ⅲ、BamHⅠ双酶切鉴定。M.5000 DNA Ladder；1.pEGFP-ORFV118 digested by Hind Ⅲ and BamHⅠ.

2.4 pEGFP-ORFV118重组质粒在睾丸支持细胞的mRNA表达水平分析

转染48 h后，提取细胞总RNA，通过RT-PCR也能扩增到与预期ORFV118基因大小相似的目的条带，表明ORFV118基因在细胞中发生了转录(图4)。

图4 RT-PCR检测pEGFP-ORFV118重组质粒的mRNA表达分析Fig.4 mRNA analysis of pEGFP-ORFV118

2.5 ORFV118蛋白在山羊睾丸支持细胞中的表达分析

Western Blot 结果显示(图5)，转染空载pEGFP-N1的山羊睾丸支持细胞内仅可见GFP蛋白(25 ku

图5 ORFV118蛋白表达的Western Blot鉴定Fig.5 Western Blot identification of ORFV118 protein

2.6 4种细胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α)的表达水平分析

结果显示，转染48 h后，与空载体pEGFP-N1相比，在转染pEGFP-ORFV118的细胞中，IL-1β和IFN-γ的mRNA转录和蛋白水平均受到了不同程度的抑制，而IL-6和TNF-α的mRNA转录和蛋白水平受到一定程度的促进(图6)。

不同小写字母表示处理较对照在0.05水平上差异显著；不同大写字母表示处理较对照组在0.01水平上差异极显著。图7—8同。Different lowercase letters indicate significant difference at the level of 0.05 between the treatment and the control；Different capital letters indicate extremely significant difference at the level of 0.01 between the treatment and the control.The same as Fig.7—8.

2.7 ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期及周期相关基因的影响

细胞周期结果显示(图7-A、B)，与空载体pEGFP-N1相比，转染pEGFP-ORFV118组S期细胞数减少(P<0.05)；与空载体pEGFP-N1相比，转染pEGFP-ORFV118组G2/M期细胞数增加(P<0.01)，可见ORFV118蛋白对细胞的DNA合成期(S期)有阻滞作用，对DNA合成后期(G2/M期)具有促进作用。周期相关基因检测结果显示，与空载体pEGFP-N1相比，ORFV118蛋白可上调基因CDK2的mRNA表达水平(P<0.01)，P21无统计学意义(P>0.05)(图7-C、D)。

2.8 ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞凋亡及凋亡相关基因的影响

结果显示，转染pEGFP-N1组的细胞早期凋亡率是25.39%，晚期凋亡率为27.02%；pEGFP-ORFV118转染组细胞的早期凋亡率是23.56%，晚期凋亡率为18.68%。可见，ORFV118蛋白抑制了细胞的凋亡作用(图8-A、B)。凋亡基因结果显示，与阴性对照组相比，ORFV118蛋白可极显著下调促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA水平(P<0.01)。Bcl-2、BaX、BCL2L11、P53、PARP1无统计学意义(P>0.05)(图8-C)。

A.pEGFP-N1对山羊睾丸支持细胞凋亡的影响； B.pEGFP-ORFV118对山羊睾丸支持细胞凋亡的影响；C.RT-qPCR检测凋亡相关基因的影响。A.Effect of pEGFP-N1 on apoptosis of goat testicular sertoli cells；B.Effect of pEGFP-ORFV118 on apoptosis of goat testicular sertoli cells C.Effect of RT-qPCR detect apoptosis-related genes.

3 结论与讨论

羊口疮病毒自1923年被发现后，直到1957年被首次分离获得[17]。随着养羊业的扩大，饲养管理的不善，导致羊口疮病毒迅速在世界范围内扩展开来。由于感染口疮的羊群导致其采食量下降，易引起其他疾病继发感染、机体消瘦、生长缓慢等现象，该病的发生对整个养羊业造成重大的经济损失[18-19]。目前，对于羊口疮病毒的治疗主要还是集中于对症治疗，尚无商品化的疫苗，因此，探究羊口疮病毒致病机理对养羊产业的健康发展是十分必要的。本研究在过表达ORFV118基因的基础上，探究了ORFV118蛋白调控新生山羊睾丸原代细胞免疫应答相关的4种细胞因子(IL-6、IFN-γ、IL-1β及TNF-α)的mRNA表达水平的影响，为进一步探讨ORFV118在诱导机体免疫应答中的作用，以及对羊口疮病毒疫苗以及新药物的研发奠定一定的基础。

生物信息学的分析可在一定程度指导基因存在的潜在生物学功能[20]。本研究成功克隆羊口疮病毒ORFV118基因的全长，长度为309 bp。对其生物信息学分析发现，该蛋白共编码102个氨基酸，分子质量约为11.58 ku，为不稳定蛋白；结构与功能预测显示，该蛋白无信号肽，无跨膜结构域，为非分泌性蛋白；Khoury等[21]研究发现，蛋白质翻译后存在磷酸化、糖基化和乙酰化等方式。本研究对ORFV118蛋白修饰结构的预测发现118蛋白在第7和87位氨基酸处有2个N糖基化位点；ORFV118蛋白有11个丝氨酸、2个苏氨酸和3个酪氨酸磷酸化位点，推测这些位点可能是调控ORFV118蛋白功能的一些关键位点。同时，二级结构预测显示，该蛋白以无规卷曲为主，提示该蛋白结构松散、不稳定。

支持细胞、间质细胞和生精细胞是山羊睾丸的3种细胞类型[22]。其中支持细胞可参与阻止外来抗原进入曲细精管，防止抗原和抗体之间产生的免疫应答[23]，且支持细胞分泌物可通过抑制淋巴细胞增殖，从而减少器官移植中的免疫排斥反应。细胞因子可通过睾丸细胞自分泌、旁分泌或者内分泌等形式产生，并通过局部调节或信号通路途径影响睾丸的功能[24]。同时，ORFV可感染山羊睾丸细胞，并引起肉眼可见的空斑，且会刺激宿主产生多种细胞因子，参与机体的免疫调节、抗病毒等作用[25]。因此，细胞因子的准确定量对评价生物机体免疫状态具有重要参考作用[26]。研究显示，在病毒感染后，病毒诱导宿主细胞NF-κB等信号通路的活化，产生以IL-1α、IL-6和IL-8细胞因子为主的信号分子，调节机体的免疫应答[27]。本试验中发现，ORFV118基因转染山羊睾丸支持细胞后可导致IL-1β和IFN-γ的表达水平明显低于阴性对照组，而IL-6、TNF-α的表达水平呈一定的上升趋势，提示ORFV118蛋白可通过调节细胞内IL-1β、IFN-γ、IL-6和TNF-α的合成和分泌的能力，进而影响机体的免疫功能。

病毒感染与宿主是一个相互博弈的过程[28-29]，通过长期的进化过程，病毒为了能使其在宿主细胞内生存，可通过各种策略来对抗宿主的防御机制[30-31]。细胞凋亡作为其中的一种，是宿主细胞应对病毒感染的重要防御作用之一。例如痘病毒家族的痘苗病毒(Vacciniavirus，VACV)编码的F1L蛋白[32]、黏液瘤病毒(Myxomavirus，MYXV)24，25[33]编码的M11L蛋白和鼠痘病毒(Ectromeliavirus，ECTV)27[34]编码EVM025蛋白已被证实对宿主细胞具有抗凋亡作用。且彭建伟[35]在研究中发现，ORFV125能抑制宿主细胞凋亡，随着时间的延长，ORFV125蛋白对宿主细胞抑制作用更加明显。ORFV118基因是羊口疮病毒两端相对不保守的基因之一，这些基因常常与宿主选择、免疫逃逸、免疫调节及病毒毒力等有关。目前，ORFV118蛋白是否对宿主细胞的凋亡产生影响尚不清楚。本研究发现，ORFV118蛋白抑制山羊睾丸支持细胞凋亡现象，且下调促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA表达水平，而对凋亡基因BaX、BCL2L11、P53、PARP1无影响。同时，本研究发现ORFV118蛋白对细胞的DNA合成期(S期)有阻滞作用，对DNA合成后期(G2/M期)具有促进作用，且下调基因CDK2的mRNA表达水平，而对周期基因P21的mRNA表达水平无影响。具体ORFV118蛋白诱导细胞凋亡的作用机制以及如何调控细胞周期仍需进一步确定。

ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞的DNA合成期(S期)有阻滞作用，对DNA合成后期(G2/M期)具有促进作用，且下调基因CDK2的mRNA表达水平。ORFV118蛋白可抑制细胞凋亡，且下调促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA表达水平；ORFV118蛋白对细胞因子IL-1β和IFN-γ起到了不同程度的抑制作用，而对IL-6和TNF-α呈促进作用。这些结果为进一步探讨ORFV118蛋白在诱导机体免疫应答及全面揭示该蛋白的功能奠定了基础。