苦瓜白粉病响应基因McMLO1的克隆及表达分析

陈龙正，刘 静，刘之洋，夏彭飞，袁希汉，宁 宇

(1.江苏省农业科学院 蔬菜研究所，江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏 南京 210014；2.南京新创蔬菜分子育种研究院有限公司，江苏 南京 211899)

苦瓜(MomordicacharantiaL.)属葫芦科苦瓜属，原产于亚洲热带地区，是一种一年生蔬菜作物。苦瓜风味独特，同时又兼具降血糖、抗肿瘤及提高免疫力等药用功效[1-2]，因此，深受人民群众喜爱。近年来苦瓜产业发展势头迅猛，尤其是在我国华南地区种植面积巨大。白粉病是苦瓜生产上面临的主要病害之一，高温高湿条件下白粉病在田间的发病率几乎达到100%[3]，严重降低了苦瓜的产量和品质。挖掘抗性基因，培育抗病品种是解决苦瓜白粉病危害最经济有效的手段。然而，目前尚无苦瓜抗白粉病基因的精细定位和克隆的报道。

MLO(MildewResistanceLocusO)是植物特有的一类基因家族，参与根的形态建成[4]、花粉管发育[5]及干旱胁迫[6]等多种生物学过程。其中，MLO基因最重要的功能之一是负向调控寄主植物对白粉病的抗病反应[7]，在一定程度上相当于植物的“感病”基因。MLO基因发生功能缺失突变后会变成隐性遗传的mlo基因，而mlo基因可使植物产生对白粉病的抗性[8]。MLO基因首先发现于大麦，其等位功能缺失突变基因Hvmlo赋予了大麦对已知所有白粉病生理小种广谱且持久的抗性[9]。拟南芥Atmlo2/6/12三基因突变可使拟南芥免疫白粉病的侵染[10]。TALEN技术诱导的MLO基因突变使普通小麦获得了可遗传的白粉病抗性[11]。利用RNAi技术沉默MdMLO19基因可有效缓解白粉病对苹果的危害[12]。上述研究均表明，MLO基因在调控寄主植物的白粉病抗性反应中发挥着重要作用。

目前，基于3代测序技术的高质量的苦瓜参考基因组已公布[13]，这为研究者快速挖掘与白粉病抗性相关的MLO基因奠定了基础。本研究拟克隆苦瓜MLO基因及其启动子，分析预测其编码蛋白的结构与序列特征及系统进化关系，并利用荧光定量PCR技术对其响应白粉病侵染的表达模式进行检测，旨在为解析MLO基因调控苦瓜白粉病感病反应的分子机理奠定基础，同时也为进一步利用该基因创制抗白粉病苦瓜种质提供理论参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料K24为江苏省农业科学院蔬菜研究所特色蔬菜课题组保存的苦瓜高代自交系，表现为对白粉病敏感。

1.2 试验方法

选取饱满的种子浸种8 h，在30 ℃的恒温箱中催芽。选取发芽整齐一致的种子播种于装有草炭、蛭石(体积比2∶1)的50孔穴盘中，放置于人工气候箱中培养(昼温/夜温为28 ℃/18 ℃，光周期为16 h/8 h)。当幼苗长至四叶一心时，对苦瓜进行白粉病人工接种。接种所用的病原菌采自江苏省农业科学院蔬菜研究所六合试验基地，经鉴定和分离后保存的瓜单囊壳白粉菌单孢株系。接种时用毛刷将发病叶片上的新鲜孢子刷入无菌蒸馏水中，使用血球计数板将孢子浓度调至1.0×106个/mL。用喷壶将配制好的孢子液均匀喷到每一片叶片上，直到叶缘有液体滴落。接种后将苦瓜幼苗放置在接种架中，四周用塑料薄膜密封以保持湿度。接种后分别取0，6，12，24，48 h的叶片组织，迅速放入液氮中用于保存备用。

1.3 苦瓜MLO基因的克隆

苦瓜MLO基因CDS的扩增：利用植物总RNA提取试剂盒RNAprep pure Plant Kit(北京天根生化科技有限公司)提取苦瓜叶片RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度计检测RNA的浓度及纯度。以高质量苦瓜总RNA为模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒(日本TaKaRa公司)操作说明反转录合成第一链cDNA。基于已公布的苦瓜参考基因组，使用Primer 5.0软件设计用于扩增苦瓜MLO基因的引物(表1)。50 μL PCR体系包括：2 μL cDNA模板，25 μL Phanta Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL及19 μL ddH2O。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环35次；72 ℃最后延伸10 min。PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段切胶、回收后连接到pEASY-Blunt克隆载体(北京全式金生物技术有限公司)上，热激法转化到感受态大肠杆菌DH5α中，挑取PCR检测为阳性的单克隆，送上海生工公司测序。

表1 本研究使用的引物Tab.1 The sequences of primers used in this study

苦瓜MLO基因全长扩增：采用改良CTAB法提取苦瓜叶片DNA。根据参考基因组序列，截取起始密码子上游1 500 bp左右的区段作为启动子，利用引物McMLO1b扩增苦瓜MLO基因全长及其启动子。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 min，循环35次；72 ℃最后延伸10 min。回收及克隆测序过程同上。

1.4 序列的生物信息学分析

苦瓜MLO基因结构采用GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)工具进行分析。利用ExPaSy Proteomics Server在线工具(http：//web.expasy.org/protparam/)对苦瓜MLO蛋白的分子量、理论等电点和蛋白质疏水性等理化性质进行预测。通过SOPMA在线工具(http：//pbil.ibcp.fr/)预测MLO蛋白的二级结构，使用TMHMM工具(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0)分析MLO蛋白跨膜结构域，利用CELLO工具(http：//cello.life.nctu.edu.tw/)进行亚细胞定位预测。采用DNAMAN 6.0软件对不同物种的MLO蛋白进行多重序列比对，采用MEGA 6.0软件构建MLO蛋白的系统进化树(Neighbor-joining法，Bootstrap值设置为1 000)。利用PlantCARE 在线工具(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对苦瓜MLO基因启动子区域的各种响应元件进行分析。

1.5 荧光定量PCR分析

以苦瓜的根、茎、叶、卷须、雄花、子房、果实等组织及白粉病接种后不同时间点的叶片cDNA为模板，分别检测苦瓜MLO基因的组织表达特异性及其在白粉病胁迫下的表达变化情况。使用Primer 5.0软件设计定量分析引物qMcMLO1(表1)，苦瓜18sRNA基因(GenBank number：XM_022288719)作为内参基因用于基因表达量的标准化(表1)。20 μL qPCR反应体系包括1 μL cDNA，正、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL，2×abm®EvaGreen qPCR MasterMix(Applied Biological Materials Inc.，Canada) 10 μL及7.4 μL ddH2O。反应在CFX96荧光定量PCR仪(Bio-Rad，USA)上进行，扩增程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。每个样本均设置3次重复。采用2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量[14]。利用SPSS 20.0软件对试验结果进行显著性方差分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 McMLO1的克隆与生物信息学分析

以苦瓜高代自交系K24的cDNA为模板，以McMLO1a为引物可扩增出1 700 bp左右的目的片段(图1)。PCR产物测序结果表明，该基因的CDS序列大小为1 707 bp，编码568个氨基酸，将其命名为McMLO1。以K24的DNA为模板进行扩增测序，发现McMLO1基因的全长序列为4 019 bp，包含15个外显子和14个内含子。

1，2，3.McMLO1基因克隆；M.2 000 bp Marker。1，2，3.Gene cloning of McMLO1；M.2 000 bp Marker.

ProtParam预测McMLO1蛋白的分子质量为65.40 ku，理论等电点为9.36；不稳定系数为48.34，表明其为不稳定蛋白；亲水性平均系数(GRAVY)为-0.062，属亲水性蛋白。McMLO1蛋白具有一个大小为477个氨基酸的MLO保守结构域，符合MLO家族的典型特征。TMHMM分析显示McMLO1蛋白具有7个跨膜结构域(图2)，CELLO预测表明，该蛋白定位于细胞膜上；在二级结构上，McMLO1蛋白存在丰富的α-螺旋(42.61%)和无规则卷曲(42.43%)，仅有少量的延伸链(10.74%)和β-转角(4.23%)(图3)。

图2 McMLO1蛋白的跨膜结构预测Fig.2 Prediction of McMLO1 transmembrane

蓝色.α-螺旋；红色.延伸链；绿色.β-转角；紫色.无规则卷曲。Blue .Alpha helix；Red.Extended strand；Green.Beta turn；Purple.Random coil.

根据McMLO1基因启动子序列的扩增测序结果，利用PlantCARE工具对区域内的各种顺式作用元件进行分析，结果表明，McMLO1启动子中含有RNA聚合酶Ⅱ起始转录所必需的CAAT-box和TATA-box元件。此外，还具备AE-box、Box 4、GATA-motif等光响应元件，ABRE、TGACG-motif等激素响应元件及WUN-motif等机械损伤响应元件，暗示该基因可能会受到这些信号的调控(图4)。

图4 McMLO1基因启动子区域顺式作用元件分析Fig.4 cis-acting elements analysis on promoter region of McMLO1

2.2 McMLO1蛋白序列比对及系统进化分析

利用DNAMAN软件对McMLO1及其他物种MLO蛋白保守结构域序列进行比对，发现其与黄瓜(Cucumissativus，XP_004142393.1)、拟南芥(Arabidopsisthaliana，Q9SXB6.1)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，XP_013451626.1)、豌豆(Pisumsativum，AGJ01118.1)、辣椒(Capsicumannuum，AFH68055.1)、番茄(Solanumlycopersicum，NP_001234814.1)、大麦(Hordeumvulgare，P93766.1)和小麦(Triticumaestivum，AAK94905.1)的序列同源性较高。其中，与黄瓜MLO蛋白同源性最高，达到86.79%。此外，研究还发现，McMLO1蛋白具有7个保守的跨膜结构域(图5)，这与TMHMM预测分析的结果相一致。

TM.跨膜结构域。TM.Transmembrane domains.

利用MEGA 5.0软件构建的系统进化树显示(图6)，苦瓜McMLO1与黄瓜、甜瓜、印度南瓜和西葫芦MLO蛋白聚为一支，这与其同属于葫芦科的分类学结论相一致；与之相比，McMLO1与蔷薇科的桃、草莓及禾本科的水稻、大麦、小麦MLO蛋白的亲缘关系则较远。

图6 不同物种MLO蛋白的系统进化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of MLO proteins from different species

2.3 McMLO1基因的组织表达特异性分析

利用qRT-PCR方法对McMLO1基因在苦瓜不同组织中的表达量进行了检测，结果显示，McMLO1基因的表达具有明显的组织特异性，在叶中的表达量最高且与其他组织间差异达显著水平(P<0.05)；其次依次是茎和卷须；在果实中的表达量最低且与其他组织间差异达显著水平(P<0.05)(图7)。上述结果表明，McMLO1基因可能主要在叶片中发挥作用。

不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。图8同。Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05.The same as Fig.8.

2.4 McMLO1基因响应白粉病侵染的表达分析

白粉病接种后，K24叶片中的McMLO1基因的表达量显著升高，并在6 h达到峰值，较接种前增加了6.2倍，且差异显著(P<0.05)。表明McMLO1基因可在白粉菌侵染早期被诱导表达。随后表达量有所降低，但在48 h又有所升高(图8)。

图8 McMLO1基因在白粉病胁迫下的相对表达水平Fig.8 Expression analysis of McMLO1 in response to powdery mildew infection

3 结论与讨论

白粉病是威胁苦瓜生产栽培最严重的病害之一，在高湿环境下的田间发病率几乎达到了100%。然而，目前高抗白粉病的苦瓜种质资源则十分稀缺[15-16]。因此，鉴定苦瓜白粉病抗性相关基因并利用其对现有品种的抗性进行遗传改良是解决苦瓜白粉病危害的关键环节。MLO基因作为一种感病基因可以负向调控寄主植物对白粉病的抗性，该基因的功能缺失突变可赋予寄主植物广谱且持久的白粉病抗性[17]。随着分子生物学的快速发展，借助TALEN、CRISPR等技术手段对MLO基因进行定向编辑可快速创制出高抗白粉病的种质。Wan等[18]利用CRISPR/Cas9技术对VvMLO3基因进行了编辑，显著提高了葡萄对白粉病的抗性。Nekrasov等[19]同样利用CRISPR/Cas9技术对SlMLO1进行基因编辑也获得了白粉病抗性显著增强的番茄。目前，在辣椒[20]、番茄[21]、甜瓜[22]等多种蔬菜作物上均克隆到了感白粉病的MLO基因。然而，苦瓜中尚未见相关报道。

本研究以苦瓜自交系K24为试验材料克隆得到了McMLO1基因。序列分析表明，McMLO1基因全长为4 019 bp，其中CDS序列为1 707 bp，包含15个外显子，编码568个氨基酸。McMLO1基因编码的蛋白含有一个由477个氨基酸组成的MLO保守结构域，证实其属于MLO基因家族。McMLO1蛋白具有7个跨膜结构域，这与已报道的MLO蛋白的典型特征相一致[23]。白粉病侵染后，MLO蛋白主要分布于质膜上并聚集在附着胞周围[24-25]。本研究中，CELLO亚细胞定位预测表明，McMLO1位于细胞膜上，这与前人的研究结果相吻合。蛋白序列比对发现McMLO1与黄瓜、豌豆等物种上已明确为白粉病感病因子的MLO蛋白的同源性较高，进化关系较为接近，暗示其可能是苦瓜白粉病感病基因，但明确的基因功能仍需进一步的遗传转化试验来验证。

MLO基因的表达具有组织特异性，且不同物种上的表达模式有所不同。野蔷薇RmMLO基因在感病叶片中的表达量最高，在根中则无表达[26]。黄瓜感病基因CsaMLO8在子叶节、叶片和果实中的表达量显著高于根和下胚轴[27]，而葡萄VvMLO3基因在根中的表达量是花和果实等组织的200倍[28]。在苦瓜中，McMLO1基因在叶片中的表达量显著高于其他组织，这也暗示该基因主要是在叶片中参与对白粉病的响应调控过程。此外，前人研究表明，白粉病感病基因MLO主要在病原菌侵染前期显著上调表达，如黄瓜CsaMLO8在白粉病侵染4 h表达量显著提升[29]，橡胶树白粉病感病因子HbMLO12在接种后6 h的转录本丰度最高[30]。本研究中，苦瓜McMLO1基因在白粉病侵染6 h表达量显著升高，且高于其他时间点，这与前人研究结果相类似，表明McMLO1是一个白粉病早期响应基因。

综上所述，本研究克隆了苦瓜McMLO1基因并对其结构特征、进化关系及表达特异性进行了分析，证实其参与了苦瓜对白粉病的响应过程。下一步，通过基因遗传转化验证McMLO1的基因功能，探究McMLO1基因调控寄主感病反应的分子机理将是后续研究工作的重点。