高效液相色谱法同时测定麻黄-桂枝药对中7 种成分含量

王东海，汤建华，杨晓媛，于小纬

（河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000）

麻黄- 桂枝药对在麻黄汤、大青龙汤等经典方剂中都有应用，是中医临床常用药对。麻黄主要有效成分为盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、盐酸甲基麻黄碱等［1］，具有镇咳平喘、发汗等作用［2］。桂枝主要有效成分为桂皮醛、桂皮醇、桂皮酸、香豆素等［3］，具有解热、镇痛、镇静等作用［4］。麻黄汤中麻黄与桂枝的配伍比例为3∶2，即麻黄用量150 g，桂枝用量100 g，为治疗外感风寒表实证的名方。麻黄发表散寒，配伍辛温之桂枝，解肌祛风，两药相须为用，增强发汗、解表、散寒之功效［5］。本研究中按麻黄和桂枝配伍比例3∶2 制备药对，参考文献［6-10］，建立了同时测定麻黄-桂枝药对提取物中麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱、桂皮酸、桂皮醇、桂皮醛和香豆素7种成分含量的高效液相色谱切换波长法，以评价麻黄-桂枝药对提取物的质量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司），配有2998 型二极管阵列检测器和2695 Alliance 型四元梯度泵；MSE 6.6S - 0CE - DM 型电子天平（赛多利斯科学仪器＜北京＞有限公司，精度为0.001 mg）；AUW120D 220D 型电子分析天平（日本岛津公司，精度为0.01 mg）；D115 型烘箱（德国Binder 公司）；KQ -500B 型超声波清洗仪（郑州宝晶电子科技有限公司，功率为250 W，频率为40 kHz）；XJA - 1A 型万能粉碎机（江苏姜堰市银河实验仪器厂）。

1.2 试药

盐酸麻黄碱对照品（批号为171241 - 201809），盐酸伪麻黄碱对照品（批号为171237 - 201510），盐酸甲基麻黄碱对照品（批号为171247 - 201502），桂皮酸对照品（批号为110786-201604），桂皮醛对照品（批号为110710 - 201821），均购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于98.0%；香豆素对照品（江苏永健医药科技有限公司，CAS 号为91 - 64 - 5，纯度大于98%）；桂皮醇对照品（南京森贝伽生物科技有限公司，CAS 号为104 - 54 - 1，纯度大于98%）；麻黄饮片和桂枝饮片均为市售（药材信息见表1），经辽宁中医药大学李峰教授鉴定为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinicaStapf.的干燥草质茎、肉桂Cinnamomum cassiaPresl.的干燥嫩枝，符合2015 年版《中国药典（一部）》规定。甲醇、乙腈（色谱纯，天津赛孚瑞科技有限公司）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

表1 麻黄-桂枝药对药材信息Tab.1 Sources information of Ephedrae Herba-Cinnamomi Ramulus herb pairs

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈（A）- 含0.1%NH4Cl 的0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min 时10%A，10～20 min 时10%A→20%A，20～30 min 时20%A→35%A，30～45 min 时35%A→50%A，45～50 min 时10%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：0～20 min 时210 nm（盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱和盐酸甲基麻黄碱），21～50 min 时250 nm（香豆素、桂皮醇、桂皮酸和桂皮醛）；柱温：30 ℃；进样量：10µL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取盐酸甲基麻黄碱对照品28.65 mg、香豆素对照品10.30 mg、桂皮醇对照品17.72 mg、桂皮酸对照品7.468 mg、桂皮醛对照品70.32 mg，精密称定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇超声处理，并稀释至刻度，作为混合对照品贮备液Ⅰ。取盐酸麻黄碱对照品56.75 mg、盐酸伪麻黄碱对照品22.56 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，精密加入混合对照品贮备液Ⅰ5 mL，加甲醇超声处理，溶解后稀释至刻度，配制成每1 mL含盐酸麻黄碱1 135.00 µg、盐酸伪麻黄碱451.20 µg、盐酸甲基麻黄碱114.60 µg、香豆素41.21 µg、桂皮醇70.89µg、桂皮酸29.87µg 和桂皮醛281.30µg 的混合对照品贮备液Ⅱ。精密量取5 mL混合对照品贮备Ⅱ液，置25 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液。

供试品溶液：取麻黄、桂枝饮片适量，粉碎，粉末混匀，过50 目筛，分别称取3.0 g 和2.0 g，精密称定，置250 mL锥形瓶中，加甲醇50 mL，称定质量，浸泡50 min，50 ℃超声（功率为250 W，频率为40 kHz）提取60 min，放冷，损失的质量用甲醇补足，过滤，取续滤液，于5 ℃、10 000 r/min转速下高速离心10 min，取上清液，即得。

麻黄、桂枝对照药材溶液：取上述麻黄、桂枝饮片粉末0.3 g、0.2 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备溶液，即得。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：分别精密吸取2.2 项下3 种溶液各10µL，按拟订色谱条件进样测定，7种待测成分与相邻峰间的分离度均大于1.5，理论板数按盐酸麻黄碱峰、盐酸伪麻黄碱峰、盐酸甲基麻黄碱峰、香豆素峰、桂皮醇峰、桂皮酸峰和桂皮醛峰均大于6 000，拖尾因子均小于1.35。麻黄对照药材溶液色谱图中，在无与桂皮醇、桂皮酸、桂皮醛和香豆素对照品溶液色谱相同保留时间处有相应峰，桂枝对照品溶液色谱中无与麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱相应的峰，表明麻黄与桂枝配伍后，对彼此的成分测定无干扰。色谱图见图1。

线性关系考察：分别精密吸取2.2项下混合对照品贮备液0.8，2.0，3.0，5.0，7.0，10.0 mL，置20 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得系列质量浓度的混合对照品溶液，分别精密量取10µL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以各成分质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表2。

表2 7种指标性成分线性关系考察结果（n=6）Tab.2 Results of the linear relation test of seven components（n=6）

精密度试验：精密吸取2.2 项下混合对照品溶液10µL，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次。结果盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、盐酸甲基麻黄碱、香豆素、桂皮醇、桂皮酸和桂皮醛峰面积的RSD分别为0.67%，0.75%，1.15%，1.34%，1.26%，0.99%，1.48%（n= 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（编号为S1）粉末适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0，5，10，15，20，35，48 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定。结果盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、盐酸甲基麻黄碱、香豆素、桂皮醇、桂皮酸和桂皮醛峰面积的RSD分别为0.43%，0.65%，1.02%，1.32%，0.89%，0.76%，1.54%（n= 7），表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

1.盐酸麻黄碱 2.盐酸伪麻黄碱 3.盐酸甲基麻黄碱 4.香豆素 5.桂皮醇 6.桂皮酸 7.桂皮醛A.混合对照品溶液 B.供试品溶液 C.桂枝对照药材溶液 D.麻黄对照药材溶液图1 高效液相色谱图1.Ephedrine hydrochloride 2.Pseudoephedrine hydrochlorid 3.Methylephedrine hydrochloride 4.Coumarin 5.Cinnamic alcohol 6.Cinnamic acid 7.CinnamaldehydeA.Mixed reference solution B.Test solution C.Reference medicinal material solution of Cinnamomi Ramulus D.Reference medicinal material solution of Ephedrae HerbaFig.1 HPLC chromatograms

重复性试验：取样品（编号为S1）粉末6 份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。结果盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、盐酸甲基麻黄碱、香豆素、桂皮醇、桂皮酸和桂皮醛的平均含量分别为3.021，1.205，0.303，0.165，0.291，1.123，0.126 mg/g，RSD分别为0.35%，0.42%，0.98%，1.31%，1.12%，0.61%，1.25%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（编号为S1）粉末适量，麻黄饮片粉末1.5 g，桂枝饮片粉末1.0 g，精密称定，共6份，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入2.2项下混合对照品贮备液4 mL，依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果见表3。

表3 7种指标性成分加样回收试验结果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test of seven components（n=6）

2.4 样品含量测定

精密量取2.2 项下混合对照品溶液、供试品溶液、麻黄对照药材溶液、桂枝对照药材溶液各10µL，按2.1项下色谱条件进样测定4 批样品（编号为S1-S4）中7 种成分的含量，结果见表4。采用SPSS 22.0 统计学软件对4 批麻黄- 桂枝药对中各成分的含量和其对应单药材中各成分的含量进行t检验数据分析，发现麻黄-桂枝配伍后，除桂皮酸外，其余6 种成分含量均显著减少（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 流动相选择

曾考察乙腈- 0.05%磷酸水溶液、乙腈- 0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.2%三乙胺水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液（含0.1%NH4Cl）。结果以乙腈- 0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液为流动相时，由于带正电荷的碱性化合物麻黄碱与带负电荷的色谱柱表面硅羟基间的离子交换会引起峰拖尾［11］，导致麻黄碱和伪麻黄碱分离度不符合要求，无法保证含量准确度；以乙腈-0.2%三乙胺水溶液为流动相时，色谱峰峰形有所改善，但各成分保留时间不稳定；以乙腈-0.05%磷酸水溶液（含0.1%NH4Cl）为流动相时，基线较平稳，7 种成分色谱峰与相邻杂质峰分离完全，对称因子在1.10～1.35 间，符合系统适应性试验的规定。故选择乙腈-含0.1%NH4Cl的0.05%磷酸水溶液为流动相。

3.2 提取条件选择

曾考察样品提取方法（超声、加热回流）、提取溶剂（甲醇、乙醇、丙酮）、浸泡时间（40，50，60 min）、提取时间（40，60，90 min）、溶剂用量（25，50，100 mL）。结果加热回流与超声两种方式的提取率相当，但加热回流操作复杂，耗时长，需要的样品初始浓度较大；以乙醇和丙酮作为提取溶剂时，桂皮醛和麻黄碱的提取率较低，以甲醇作为提取溶剂时，7 种成分的提取率最高，含量测定结果的RSD均小于1.5%；浸泡时间和提取时间分别为50 min 和60 min 时，浸泡和提取较充分；提取溶剂量为50 mL 时。7 种成分响应值适中。故确定甲醇作溶剂、浸泡50 min、超声处理60 min、提取溶剂量为50 mL为麻黄-桂枝药对的最佳提取条件。

3.3 麻黄-桂枝配伍化学含量与药效分析

由表4可知，麻黄-桂枝配伍后，除桂皮酸外，麻黄和桂枝中7种成分的溶出较单味药材均显著减少（P＜0.05），与徐文杰等［12］麻黄- 桂枝不同比例配伍前后水煎液中有效成分的含量较单味药材均减少的研究一致。徐文杰等［13］的研究表明，麻黄-桂枝配伍后，麻黄中麻黄类生物碱的溶出减少，使配伍表现出减毒作用。郑芳昊［14］的研究发现，麻黄-桂枝药对配伍后，可使试验动物的中枢神经系统功能从兴奋趋于正常。方芳［15］指出，麻黄- 桂枝配伍后解热作用增强，说明麻黄- 桂枝药对配伍后利于解热，其中麻黄- 桂枝药对的配伍比例为3∶2 时的解热作用最佳。由此可知，麻黄类生物碱是麻黄的效、毒两性成分，麻黄与桂枝相须为用，配伍后麻黄的毒性减弱。但麻黄- 桂枝不同比例配伍后各有效成分的含量及药之间的关系有待进一步研究。

表4 样品含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.4 Results of content determination of seven components in the samples（mg/g，n=3）