不同检测方法对鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌的鉴定结果比较及同源性分析*

赵智龙，姚汶艺，宫海燕，史 松

新疆医科大学第五附属医院：1.检验科；2.营养科；3.医务部，新疆乌鲁木齐 830011

对临床分离的病原菌进行精确、快速的鉴定是抗感染治疗的主要途径，针对病原菌科学使用抗菌药物，可有效控制耐药菌的产生与传播，降低医疗成本与病死率。随着抗菌药物的广泛使用及病原菌的变异，传统的细菌生化鉴定法已经无法满足临床耐药菌诊治的发展需求。荧光杂交和聚合酶链式反应鉴定方法较为准确，但成本昂贵且费时，不适用于临床标本的常规鉴定[1- 2]。近年来，基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)通过样品制备、蛋白提取、图谱分析和统计学评价等步骤，可以实现对细菌属、种、亚种乃至株水平上的准确快速鉴定[3]。MALDI-TOF MS已被广泛应用于临床病原菌的快速鉴定，该方法快速、高效，可为临床治疗提供有效的帮助[4]。由于细菌在不同地域存在一定差异，对本地菌株进行不同方法学的鉴定比较，可有效提高临床病原菌的鉴定水平。因此，本研究比较MALDI-TOF MS与细菌生化鉴定两种方法对临床常见病原菌鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌的鉴定差异，并进行同源性分析，旨在为临床抗感染治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 新疆医科大学第五附属医院2019年3-4月从临床标本分离出的40株鲍曼不动杆菌敏感菌株、40株大肠埃希菌敏感菌株。

1.2仪器与试剂 MALDI-TOF MS所用甲酸(美国赛默飞世尔科技公司，批号：151817)、乙腈(美国赛默飞世尔科技公司，批号：167900)、α-氰-4-羟基肉桂酸(美国赛默飞世尔科技公司，批号：SHBD0586V)、三氟乙酸(美国赛默飞世尔科技公司，批号：153080)、无水乙醇(美国赛默飞世尔科技公司，批号：159116)均为色谱纯，购自Fisher Chemical。培养基为含5%～10%羊血的营养琼脂(中国北京陆桥技术有限公司)，标准菌株为大肠埃希菌ATCC8739。质谱仪Clin-TOF Ⅱ型基质辅助激光解析/飞行时间质谱(中国北京毅新博创生物科技有限公司)，VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统(法国生物梅里埃公司)。数据采集软件为Shimadzo Biotech MALDI-MS 2.9.3(中国北京毅新博创生物科技有限公司)，微生物鉴定软件及聚类分析软件均为MicroID version 4.0(中国北京鑫汇普瑞公司)，测序反应试剂盒为Big-dye试剂盒(美国ABI公司)，Taq酶采用TaqHotStart DNA Polymerase(日本Takara公司)，扩增仪为Verity PCR仪扩(美国ABI公司)，测序采用3730XL测序仪(美国ABI公司)。

1.316S rRNA测序 引物序列根据基因序列信息，采用的Primer5.0软件由北京博云辉科技有限公司设计并合成，F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，R：GGTTACCTTGTTACGACTT；采用Big-dye试剂盒的25 μL反应体系,预变性95 ℃ 300 s，扩增35个循环，循环参数:95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s，然后72 ℃ 300 s保温。16S rRNA测序结果，采用NCBI网站数据进行比对鉴定，采用mega7.0进行同源性分析。

1.4MALDI-TOF MS鉴定 标准菌株和待检菌株均提取蛋白后用于鉴定。用接种环取菌落约5 mg，置于盛有300 μL纯水的1.5 mL离心管中，振荡均匀。向离心管中加入900 μL无水乙醇，振荡，用漩涡仪混匀3～5 s。混合后用离心机以12 000 r/min离心2 min，弃去上清液，再次以12 000 r/min离心2 min，吸弃剩余液体，置于室温干燥5 min。加入40 μL 70%甲酸，充分振荡，漩涡仪混匀3～5 s，之后再加入40 μL乙腈，充分振荡，漩涡仪混匀3～5 s，用离心机以12 000 r/min离心2 min后，用移液枪吸取1 μL上清液点到靶板上，待室温干燥后加1 μL基质溶液覆盖在样品点上，室温条件下自然晾干。标准菌株大肠埃希菌ATCC8739作为质量控制，将金属靶板放入仪器中检测。为确保细菌鉴定的准确性，最大化降低系统误差和人工操作误差，同一株菌由3名人员分别提取蛋白样品检测。鉴定时，同一株菌每名人员点靶24个位点，共72个位点。MALDI-TOF MS采集细菌肽质量谱，所用参数如下：激光频率40 Hz，激光能量64%，选择线性正离子模式。采集分子量为2 000～20 000的肽质量谱。每个标本的肽质量谱在不同位置经过500次激光点击获得。首先利用标准菌株的特征峰数据对设备进行分子量校准，然后再将待测菌株的数据与MicroID 4.0数据库中的图谱进行比对，然后给出相应的分值，并得出鉴定结果。蛋白质特征图谱采用MicroID 4.0进行相似度比对；MALDI-TOF MS结果和VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定仪结果分别与16S rRNA进行比较：(1)一致即判定为鉴定正确；(2)不一致即判定为鉴定错误；(3)未鉴定出结果，即判定为失败鉴定。

1.5细菌生化鉴定 采用VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定仪对标本进行细菌生化鉴定。

1.6统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1MALDI-TOF MS与细菌生化鉴定的结果比较

2.1.1细菌生化鉴定 采用VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定仪从临床标本中分离出40株鲍曼不动杆菌待测菌、40株大肠埃希菌待测菌。

2.1.2鲍曼不动杆菌鉴定比较 将16S rRNA基因测序结果通过NCBI进行比对，结果显示，通过细菌生化鉴定出的40株鲍曼不动杆菌待测菌中有19株鲍曼不动杆菌，21株非鲍曼不动杆菌；MALDI-TOF MS鉴定结果为鲍曼不动杆菌19株、皮特不动杆菌12株、医院不动杆菌3株、抗辐射不动杆菌2株，4株未鉴定出。除4株未鉴定出的标本，MALDI-TOF MS对其余菌株的鉴定结果与16S rRNA基因测序结果一致性较好(90.00%)。细菌生化鉴定结果显示，40株待测菌均为鲍曼不动杆菌，与16S rRNA基因测序的鉴定结果的一致性较差(47.50%)。

2.1.3大肠埃希菌鉴定比较 将16S rRNA基因测序结果通过NCBI进行比对，结果显示，40株通过细菌生化鉴定出的大肠埃希菌待测菌均为大肠埃希菌；MALDI-TOF MS、细菌生化鉴定与16S rRNA基因测序的鉴定结果一致(100.00%)。

2.1.4基于鉴定结果的判别比较 对两组仪器鉴定方法结果的准确性进行比较，对鲍曼不动杆菌的鉴定差异具有统计学意义(P<0.05)，对大肠埃希菌的鉴定差异无统计学意义(P>0.05)。MALDI-TOF MS有4株失败鉴定结果，细菌生化鉴定无失败鉴定结果，细菌生化鉴定有21株鉴定错误结果，均是对鲍曼不动杆菌复合菌无法进行辨别鉴定，见表1。

表1 MALDI-TOF MS与细菌生化鉴定的结果比较(n)

2.2鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌的MALDI-TOF MS谱图与聚类分析 将通过16S rRNA基因测序筛选出的鲍曼不动杆菌(19株)、大肠埃希菌(40株)的谱图，采用MALDI-TOF MS法采集特征峰谱图，获得的谱图显示，鲍曼不动杆菌都有m/z4244、m/z4257、m/z5746、m/z8485、m/z8510峰；大肠埃希菌都有m/z4364、m/z4497、m/z4613、m/z5095、m/z5116、m/z5339、m/z5402、m/z5611、m/z6275、m/z6410、m/z6507、m/z7158、m/z7870、m/z9065、m/z9742峰。

2.3同源性分析 采用MicroID 4.0对鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌的特征图谱进行相似度比对，结果用树状图表示(图1、2)，其中横坐标表示的百分比越小，图谱同源性越差。从同源性树状图可以看出，除了B5号菌株同源性较差外，鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌大多数同源性在70%以上，基本可以归为同一菌种。采用mega7.0对筛选出的鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌的16S rRNA结果进行同源性分析。其中鲍曼不动杆菌同源性达96.36%(图3)，大肠埃希菌同源性达到94.92%(图4)。基于质谱的特征图谱和分子生物学的同源性分析，可以看出两种分析方式得出的同源性存在一定的差异。质谱的特征图谱的相似度比对，鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌大多数同源性在70%以上。16S rRNA测序的基因序列比对所得的同源性分析，鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌大多数同源性在95%以上。不同的方法学，对于同源性的百分比范围有所差异，但在相应的范围可评价菌种之间的同源性情况。

图1 鲍曼不动杆菌质谱图的聚类图

图2 大肠埃希菌质谱图的聚类图

图3 鲍曼不动杆菌16S rRNA的同源性树状图

图4 大肠埃希菌16S rRNA的同源性树状图

3 讨 论

通过对鉴定结果的准确性进行比较，MALDI-TOF MS与细菌生化鉴定在对鲍曼不动杆菌的正确鉴定上存在一定的差异，MALDI-TOF MS的正确鉴定率高于细菌生化鉴定。16S rRNA基因测序与MALDI-TOF MS鉴定鲍曼不动杆菌的一致性为90.00%，与生化鉴定的一致性为47.50%；对于大肠埃希菌，16S rRNA基因测序与MALDI-TOF MS鉴定、生化鉴定的一致性均为100.00%。基于质谱的特征图谱和分子生物学的同源性分析进行比较，同源性存在一定的差异，但在相应的范围仍可评价菌种之间的同源性情况。总体来说，MALDI-TOF MS对鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌鉴定结果的准确性较高，鉴定能力较强，对临床感染的诊断具有一定的鉴定价值。

目前，建立在细菌形态学、细胞生理和生化基础上的传统鉴定方法是临床微生物实验室鉴定细菌的主要方法。传统的生化鉴定有易操作、耗材便宜等特点，但也存在报告时间较长、结果的准确性依赖于操作人员的技术水平、无法及时准确地向临床反馈结果等不足[5]。随着核酸技术发展，序列测定被用于细菌精准鉴定，但仍有鉴定周期长、对实验室及操作人员有着极高的要求等特点。而近年来质谱鉴定技术的兴起，开启了细菌鉴定的新时代，微生物工作者们开始从蛋白质水平对微生物进行鉴定。MALDI-TOF MS可以很好地弥补生化鉴定的不足，适合大批量标本的鉴定，快速报告结果，将传统方法的报告时间从2～4 d缩短到几个小时[6]。本研究将细菌生化鉴定和MALDI-TOF MS结果与更加精确的测序法进行对比，可以看出，MALDI-TOF MS的稳定性和一致性比传统的细菌生化鉴定更好。对于传统细菌生化鉴定无法区分的相似菌种，诸如鲍曼不动杆菌复合菌的鉴定，MALDI-TOF MS就可以很好地对其进行区分，其分辨率与16S rRNA基因测序基本一致。

受不同地区气候、环境、经济等因素的影响，质谱特征峰会有些许差别，由此会导致某些菌株鉴定失败。通过建立本地区细菌菌株的特征图谱，可以有效避免因地区差异造成的鉴定失败，并及时准确地向临床报告鉴定结果[7-8]。此外，为了实现最佳匹配，提高其分型鉴定能力，需要足量的病原菌构建本地区菌株数据库。随着对生物标签的广泛研究和图库数据库的不断完善，MALDI-TOF MS得到了广泛的应用[9-10]。研究表明，在对多种细菌感染的鉴定中，需实行传统技术、流程以避免漏检，并应用联合检测方法进行相互补充，以优化流程和提升鉴定能力[11-12]。