酶法提取餐厨垃圾蛋白质工艺研究

吴 伟，杨 军,2，毛燕宁

(1.兰州交通大学 环境与市政工程学院，甘肃 兰州 733000；2.甘肃省黄河水环境重点实验室，甘肃 兰州 733000)

1 引言

餐厨垃圾与其他垃圾相比，具有含水量、有机物含量、油脂含量及盐分含量高，营养元素丰富等特点，具有很大的资源化利用价值[1]。我国餐厨垃圾产生量大且实际处理能力不超过1.4 万t/d，日处理率不到6%，中国每年餐厨垃圾产量超过美国、日本和韩国总和的3 倍以上[2]，中国餐厨垃圾的问题特别突出且亟需解决。

餐厨垃圾主要为蛋白质、脂肪、淀粉、木质纤维素等各种大分子有机聚合物组成，富含钾、钙、镁等一些微量元素，具有很高的回收利用价值[3]。我国餐厨垃圾的组成复杂，传统的方式并不能对其进行有效的处理，寻找一种高效无害化、深度资源化的餐厨垃圾处理方法具有重要的意义[4]。

目前，酶的应用日益广泛，主要是在生物燃料生产、食品改性、洗衣、生物医学、药物研究和农业工业废物转化等领域[5～7]。G-Bustos用纤维素酶降解餐厨垃圾，有不错的效果[8]，I Imaim利用纤维素酶降解餐厨垃圾，酶解糖化率约30%[9]。J Niu也利用纤维素酶降解餐厨垃圾后，酶解糖化率达到36%[10]。吕健用纤维素酶对餐厨垃圾进行酶解[11]，朱振新采用不同蛋白酶搭配，降解模拟餐厨垃圾，均有良好效果[12]。

研究以餐厨垃圾为原料，采用蛋白酶提取餐厨垃圾中的蛋白质，并在单因素试验的基础上进行响应面优化试验，探求酶解法提取餐厨垃圾蛋白质的最佳工艺条件，旨在更好利用餐厨垃圾资源，开发具有高附加值的蛋白质产品，推动国内酶解提取餐厨垃圾中蛋白质，在最大程度上对餐厨垃圾进行资源化利用。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

餐厨垃圾：实验所采用的餐厨垃圾分别按照(质量分数)30%的米饭、10%的辣椒、10%的白菜、10%的鸡胸肉、10%的豆腐和豆皮、30%的食用油配置而成。其中，米饭取自于学校食堂，辣椒、白菜、鸡胸肉、豆腐和豆皮、食用油来自于学校附近的菜市场，将上述样品用粉碎机打碎，之后置于4 ℃冰箱内保存待用。

酶制剂：木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶；其他试剂均为国产分析纯。

2.2 仪器与设备

雷磁PHS-3C型台式pH计：山东省济南市历城区博科集团总部；TG16 台式高速离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；欧莱博OLB-WB26恒温水浴锅：济南童鑫生物科技有限公司；高速粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司。

2.3 试验方法

2.3.1 酶解过程

称取打碎的餐厨垃圾10 g，加入50 mL的蒸馏水，按照料液比1∶5比例进行混合均匀，加入一定量的蛋白酶进行酶解，酶解结束后，放入沸水浴中灭活15 min，然后冷却10 min，在4000 r/min离心20 min，然后取上清液进行蛋白质浓度的测定。

2.3.2 蛋白质的测量

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质[13]。

蛋白质提取率=(酶解后的蛋白质浓度-酶解前的蛋白质浓度)/酶解后的蛋白质浓度

2.3.3 酶解单因素实验

以蛋白质提取率为考察指标，选择初始温度、pH值、酶解时间和酶加量4个因素进行单因素试验。每组试验重复3 次，取平均值。

2.3.4 酶解动力学的研究

为了预测和控制酶解过程中餐厨垃圾水解效果，提高蛋白质的产量对酶解餐厨垃圾提取蛋白质的动力学进行研究。

(1)

式(1)中，v为反应速率，mg/h；[S]为底物浓度，mg/L；Vmax为最大反应速率，mg/h；Km为米氏常数。

2.3.5 固态蛋白质提取研究

固态蛋白质分离沉淀最常用的方法就是等电点沉淀法。从试验中获得的上清液称为蛋白质溶液。从6个烧杯中取出100 mL蛋白质溶液，用1 mol/L盐酸溶液调节pH。然后将蛋白质溶液放入-4 ℃的冰箱冷藏1.5 h，以8000 r/min离心20 min对固体蛋白质进行提取。

3 结果与分析

3.1 单一酶种类筛选

由表1实验结果可知：木瓜蛋白酶对餐厨垃圾中蛋白质的提取率最高，为35.50 %，其次分别为菠萝蛋白酶、中性蛋白酶，碱性蛋白酶，提取率分别为34.16%，22.14%，19.31%，木瓜蛋白酶对餐厨垃圾中蛋白质提取效果最好，其次是菠萝蛋白酶和中性蛋白酶，碱性蛋白酶的提取效果较差，因此，选用木瓜蛋白酶作为单一酶提取餐厨垃圾中的蛋白质。

表1 蛋白酶种类的筛选

3.2 单因素实验结果

3.2.1 pH值对粗蛋白提取率的影响

当pH值等于或接近该酶的最佳活性pH值时，可获得较好的酶解效果。从图1可以看出，随着pH值的升高，粗蛋白提取率呈下降趋势，说明木瓜蛋白酶在酶解餐厨垃圾的过程中，最适pH值在4附近，随着pH值的增加，酶分子结构发生改变，导致酶失活。因此，最适酶解pH值为4.0。

图1 pH值对粗蛋白提取率的影响

3.2.2 温度对粗蛋白提取率的影响

从图2可以看出，随着温度的增加，粗蛋白提取率先增加后减少。当温度小于40 ℃时，粗蛋白提取率呈上升趋势，说明由于温度过低，未达到木瓜蛋白酶作用的最适温度；当温度大于40 ℃，粗蛋白提取率迅速下降，并且在80 ℃，粗蛋白提取率达到最低，与最高的蛋白质提取率相差44.87%，由于酶的化学本质是蛋白质，当温度过高时，引起蛋白质变性，致使酶失活，从而降低反应速率，后面蛋白质的释放，仅仅依靠水解进行。因此，确定最佳酶解温度为40 ℃。

图2 温度对粗蛋白提取率的影响

3.2.3 酶解时间对粗蛋白提取率的影响

由图3可知，当酶解时间为0～1 h时，粗蛋白提取率呈现上升趋势，说明在该时间段酶解反应还未达到适宜条件，酶解继续，蛋白质被更多的释放出来。当酶解时间达到1 h之后，粗蛋白提取率呈现下降趋势，然后在2.5 h之后趋于平衡状态，其原因可能是餐厨垃圾中的蛋白质已经被完全释放出来了，即使延长酶解时间，粗蛋白提取率没有明显的增加，所以粗蛋白提取率也没有明显增幅。因此，确定最佳酶解时间为1 h。

图3 酶解时间对粗蛋白提取率的影响

3.2.4 酶加量对粗蛋白提取率的影响

由图4可以看出，当酶加量为30 mg时，粗蛋白提取率明显高于其他酶加量下的粗蛋白提取率。说明酶量过多或者过少，都会对粗蛋白提取率有一定的影响。酶添加量过大或者过小，都会影响酶解反应速率，从而影响餐厨垃圾中蛋白质的释放，进一步影响粗蛋白的提取率。由此可知，底物浓度充分的情况下，酶量的增加可使蛋白酶分子与底物碰撞的几率增大，提升与底物结合的效率[14]。因此，酶解最佳酶投加量为30 mg。

图4 酶加量对粗蛋白提取率的影响

3.3 酶解动力学

从图5可以看出，在保持酶浓度不变的条件下，随着底物浓度的增加，蛋白质浓度的增加速度呈现先上升后趋于平稳的走势。在底物浓度大于40 g/L时，反应速度基本保持不变，当底物浓度过量时，反应速率基本不受底物浓度的影响。在此区域范围内，酶反应速度相对于底物浓度是零级。图6表明：木瓜蛋白酶酶解餐厨垃圾的动力学遵循米氏方程的规律(表2)。

图5 底物浓度与酶促反应初速度的关系

图6 餐厨垃圾酶解动力学曲线

表2 酶解动力学参数

根据图所得线性方程，可以得出木瓜蛋白酶水解下的米氏常数、最大反应速率，将所得参数代入式(2)可得水解反应的速率方程，结果如下式：

(2)

3.4 固态蛋白质的提取

通过水酶法得到餐厨垃圾蛋白质提取液。从图7中可以看出，随着pH值的增加，蛋白质析出质量先增加后减小，沉淀分离蛋白质最多的点在pH值为6。说明木瓜蛋白酶水解餐厨垃圾得到的蛋白质提取液的最佳等电点为6，此处聚集了提取液中最多的蛋白质群或者该等电点的蛋白质的含量是最多的。在最佳等电点pH值为6沉淀分离出来的蛋白质质量为23.49 mg/mL。说明等电点法可以对餐厨垃圾酶解液中的粗蛋白进行沉淀分离。

图7 蛋白质沉淀析出质量

4 结论

(1)在餐厨垃圾酶解单因素实验的基础上，使用最佳条件进行了3 次重复试验，粗蛋白提取率为43.18%，说明酶解法适用于餐厨垃圾中蛋白质的提取研究。

(2)酶解动力学的研究表明，木瓜蛋白酶酶解餐厨垃圾符合经典的表征酶催化反应特征的米氏方程所绘制的曲线，表明木瓜蛋白酶酶解餐厨垃圾的动力学遵循米氏方程的规律。

(3)确定最佳等电点，对餐厨垃圾酶解液中的固体蛋白质定向沉淀分离的研究，对后续沉淀分离出氨基酸提供基础，从而拓宽了餐厨垃圾蛋白质的利用范围。