变应性鼻炎大鼠TNFAIP3基因在鼻腔上皮细胞的表达

郭宇峰 高兴强 邓海燕 刘美莲 陆旖

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是易感个体接触变应原后由特异性IgE 介导的鼻黏膜的非感染性炎性疾病。AR患病率在全球范围内逐年上升，患病率为2.2%～45.1%。我国AR发病率也在不断升高，我国成人AR自报平均患病率则为11.4%,中国同龄儿童AR患病率为10.4%，并且每年以0.33%的速度上升[1-2]。对于变应性鼻炎的发病的机制尚无定论，目前研究热点包括遗传基因的影响、免疫功能紊乱及环境因素等方面。近年来对AR致病基因的研究发现有多个与它相关的候选基因区。美国学者Dixit等[3]发现了一种具有高度生物活性的胞质蛋白质，命名为肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（tumor necrosis factor alpha-induced protein 3，TNFAIP3）。大 量 研究表明，TNFAIP3作为促炎因子核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的负调控因子，是机体炎症反应的保护因素之一[4-6]。TNFAIP3近年来成为治疗炎症性疾病的潜在靶点而受到关注。本实验在2019年1月—2020年1月开展，利用变应性鼻炎大鼠模型，在其致敏-治疗过程中研究TNFAIP3基因在鼻腔黏膜上皮的表达，研究其与变态反应进程的关系，为探讨TNFAIP3在免疫进程中的作用、能否作为AR治疗的新思路提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料

健康Wistar大鼠24只，雌雄各半，普通级，6～8周龄，体质量250～300 g。购自厦门大学实验动物中心，由厦门大学实验动物科学部代养。该研究获得厦门市儿童医院伦理委员会的批准。实验动物随机分为三组，每组8只。

1.2 动物模型的建立与模型评价

AR大鼠（取16只）参照文献[7]方法进行建模。基础致敏阶段：造模大鼠每只以卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美国Sigma，货号A5503-1G）0.3 mg作抗原，氢氧化铝粉末（美国Sigma货号239186-25g）30 mg作为佐剂，加生理盐水1 mL形成混悬液腹腔注射；隔日1次，共7次（第1～14天的单数日）。加强致敏阶段：腹腔注射完成后，每只大鼠以0.25%卵清蛋白生理盐水雾化吸入10 min，1次/d，连续5 d（第15～19天）。激发阶段：间歇3 d后，以10%卵清蛋白用微量加样器滴入大鼠双侧鼻腔，20 μL/次，1次/d，共7次（第23～29天）。打喷嚏和挠鼻次数在最后一次激发结束后10 min进行计数。治疗组（8只）：模型组中选择8只做治疗组，给予西替利嗪滴剂（商品名：仙特明；生产企业：UCB Pharma S.p.A意大利；批准文号：进口药品注册证号H20110137；规格：10 mL∶100 mg），1次/d，每次20 μL滴鼻，连续2周。模型组（8只）：除治疗组外的剩余AR大鼠给与生理盐水滴鼻。对照组（8只）：全程只用生理盐水（正常组）。

AR大鼠模型主要表观指标：（1）出现擦鼻、喷嚏、流涕、鼻塞等局部过敏症状；（2）滴鼻激发后症状明显增加；（3）按过敏反应行为的评分标准进行评分。表观指标可量化积分或半量化分级。喷嚏次数：1～3次为1分，4～10次为2分，≥11次为3分；抓鼻次数：1～4次为1分，4次以上为4分；清涕：流至前鼻孔为1分，超出前鼻孔为2分，涕流满面为3分。进行积分累加，其症状观察时间为每次给致敏物开始计时，共30 min，总评分≥5分判定为成功致敏。

1.3 大鼠鼻腔黏膜标本的获取

杀死大鼠，先取鼻中隔黏膜，将鼻部中间往上剪开，暴露鼻甲，镊子从鼻中插入，向上掀开鼻甲骨，找到鼻中隔，小心剥离两侧附着的黏膜，一份固定做免疫组化，一份-80℃冻存。

1.4 组织病理学分析

应用免疫组织化学法检测不同处理组的24个大鼠鼻腔黏膜组织的NF-κB、TNFAIP3的表达情况。大鼠鼻腔黏膜组织用4%多聚甲醛固定，流水滴洗，经不同浓度的乙醇梯度脱水，二甲苯进行组织透化后石蜡进行包埋，包埋后的蜡块进行连续切片。按抗体说明书条件NF-κB、TNFAIP3均以柠檬酸修复液（pH 6.0）煮沸修复15 min；免疫组化油笔在组织周围3～5 mm处画圈，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，5 min/次；阻断、灭活内源性过氧化物酶；正常羊血清工作液封闭非特异位点；按各抗体工作浓度稀释抗体，滴加一抗4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，5 min/次；滴加二抗，37℃孵育15 min，PBS冲洗3次，5 min/次；滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶，37℃孵育15 min，PBS冲洗3次，5 min/次；DAB反应染色，显微镜下观察显色情况，自来水充分冲洗结束显色；苏木素复染5 min，流水冲洗，自来水浸洗5 min返蓝；脱水透明，中性树胶封片。并应用苏木素-伊红染色（HE染色）后光镜下观察检测鼻黏膜组织中嗜酸性粒细胞的分布情况。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应检测

采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR）对各组动物鼻黏膜样本中NF-κB和TNFAIP3基因mRNA的含量进行检测（引物序列见表1），实验按照实时荧光定量RT-PCR试剂盒所规定的步骤进行，实验所得数据用ΔCT法表示。

表1 qPCR引物序列

1.6 统计学处理

采用 Graphpad Prism 6统计软件分析所得数据，数据经检验呈正态分布，样本量较小，计量资料以（±s）表示，两组间差异的比较采用t检验，多组间差异的比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AR大鼠模型的建立

AR组大鼠可见擦鼻、喷嚏、流涕、鼻塞等局部过敏症状；滴鼻激发后症状明显增加；评分总分均≥5分。模型组平均评分（6.31±0.57）分，明显高于正常组的（0.92±0.18）分及治疗组的（1.35±0.51）分，模型组与正常组相比差异有统计学意义（t=56.11，P＜0.01），模型组与治疗组相比差异有统计学意义（t=32.70，P＜0.01），说明AR大鼠模型建立成功。

2.2 组织病理学变化

嗜酸性粒细胞染色主要是检测样本组织中嗜酸性粒细胞的存在和分布情况，对照组和治疗组的所有组织切片中未观察到嗜酸性粒细胞的存在，模型组部分组织中存在嗜酸性粒细胞密集分布的情况（如图1）。

图1 大鼠鼻中隔黏膜组织上皮嗜酸性粒细胞浸润情况（HE染色，×400）

进行免疫组化NF-κB指标检测的样本切片阅片可见模型组切片阳性显色密集，治疗组有阳性显色，对照组仅有散在的阳性显色，各组切片有明显差异（如图2）。

图2 大鼠鼻中隔黏膜NF-κB胞浆表达情况（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法，×400）

免疫组化TNFAIP3指标检测的样本切片阅片可见治疗组与对照组切片均有较密集的阳性显色，两组间对比差异不大，模型组呈阴性表达，模型组对比治疗组与对照组有显著差异（如图3）。

图3 大鼠鼻中隔黏膜TNFAIP3胞浆表达情况（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法，×400）

2.3 鼻黏膜组织中NF-κB、TNFAIP3基因在对照组、模型组及治疗组中的表达水平

模型组TNFAIP3基因表达水平（4.601±0.796）、对照组（7.430±1.026）、治疗组（7.175±0.804）；模型组比对照组低，差异有统计学意义（t=2.178，P＜0.05）；模型组比治疗组低，差异有统计学意义（t=2.274，P＜0.05）；治疗组与对照组比较差异无统计学意义（t=0.195，P＞0.05）。模型组NF-κB基因表达水平（6.046±0.665）、对照组（3.498±0.663）、治疗组（4.056±0.333），模型组比对照组高，差异有统计学意义（t=2.714，P＜0.05），模型组比治疗组高，差异有统计学意义（t=2.677，P＜0.05），治疗组与对照组比较，差异无统计学意义（t=0.175，P＞0.05）。

3 讨论

变应性鼻炎是以清水样鼻涕、鼻塞等临床表现为主，可伴眼部症状及耳部症状，不危及生命，但会显著影响患者的生活质量。随着近年来对其发病机制的研究不断深入，对AR致病基因的研究发现有多个与它相关的候选基因区，NF-κB是研究的热点之一，NF-κB的激活使变态反应炎症因子级联放大，形成炎症风暴，众多文献证明其在AR中起关键作用[8-9]。TNFAIP3蛋白同时具有泛素化以及去泛素化两种功能，作为NF-κB的负调控因子，是机体炎症反应的保护因素之一[10]。早期细胞系实验发现持续过表达的TNFAIP3可显著抑制NF-κB的激活，降低NF-κB靶基因的表达，包括细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）,白介素-8（interleukin-8，IL-8），核因子κB的抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκBα）组织因子，血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1），白介素-6（interleukin-6，IL-6）以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）。TNFAIP3负调节NF-κB的生物活性，主要是通过抑制肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）途径和Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）途径来实现的[11-12]。TNFAIP3基因敲除小鼠模型证明了其在炎症负调控中的重要作用，TNFAIP3-/-小鼠在出生后不久即死于多器官的严重炎症和组织多发损伤，包括肝脏、肾脏、肠道、关节及骨髓等[13]。Lee等[14]研究发现TNFAIP3蛋白过表达可抑制由TNF，白介素-1（interleukin-1，IL-1）及脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后核转录激活因子-1（activator protein-1，AP-1）的激活从而改善小鼠溃疡性结肠炎的炎症表现。TNFAIP3近年来成为治疗炎症性疾病的潜在靶点而受到关注。

本实验免疫组化发现AR大鼠模型组鼻黏膜组织中炎症因子NF-κB指标阳性显色，RT-PCR检测也发现鼻腔黏膜组织中NF-κB基因表达在模型组中高于治疗组与对照组。NF-κB作为炎症和免疫反应的枢纽因子，在炎症反应中发挥级联放大瀑布效应，在变态反应中发挥重要作用。本实验模型组大鼠鼻黏膜免疫组化TNFAIP3指标检测治疗组与对照组切片均有较密集的阳性显色，而模型组为阴性表达，两者对比有显著差异。RT-PCR检测也发现TNFAIP3 mRNA在模型组中低于治疗组与对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。TNFAIP3作为促炎因子NF-κB的负调控因子，其水平下降意味着对NF-κB的负调控能力下调，后者升高可带来一系列严重的炎症反应，即模型组小鼠出现明显的喷嚏、流涕等变应性炎症症状。本实验治疗组TNFAIP3的表达较模型组明显增高，而NF-κB降低，大鼠鼻腔炎症反应减轻。说明TNFAIP3升高可下调NF-κB因子水平来降低气道高反应性并抑制气道炎症因子级联瀑布效应。

随着遗传学的研究进展，越来越多的学者认为变应性鼻炎的多种表现型都处于较强的遗传控制之下，是一种具有多基因遗传倾向的疾病；目前已知基因如IL-23R、MRPL4及TNF-α的SNP均与AR易感性有关[15]。国内学者发现TNFAIP3基因多态性与汉族人群AR遗传易感性有关，杨盈琳等发现TNFAIP3基因的rs9494885SNP位点及rs7753873SNP位点与AR遗传易感性密切相关[16]。且有研究报道在AR人群中鼻黏膜TNFAIP3基因和蛋白的表达水平较健康对照组降低，与本实验动物模型研究指标一致[17]。除外变应性疾病，国内外较多文献报道在各类自身免疫病及炎症疾病人群中TNFAIP3的表达均较正常人群低。如Bruno等[18]发现在克罗恩病患者中，炎性结肠黏膜组织的TNFAIP3基因表达低于健康对照者；Wang等[19]发现TNFAIP3蛋白表达的下降与欧洲和韩国人群中SLE的发病呈显著相关；魏洁琼等[20]发现甲亢组外周血中锌指蛋白TNFAIP3mRNA 表达水平低于正常对照组，低水平的TNFAIP3表达可能在甲亢Graves病发生发展免疫应答中起到作用。但在国内也有文献报道AR模型小鼠鼻黏膜中TNFAIP3mRNA和蛋白表达水平增高，作者推测急性炎症诱导了TNFAIP3的表达，从而抑制NF-κB的炎症反应[21]。此结果与本实验相反，可能为炎症急性期TNFAIP3在鼻黏膜中表现出应激性增高，随着炎症的进展，TNFAIP3的表达逐渐降低。

综上所述，变应性鼻炎的发生发展与许多炎症因子密切相关。其中锌指蛋白TNFAIP3作为炎症触发因子NF-κB的负调控因素，为阻止机体发生变态反应发挥了不可替代的作用。本实验通过动物模型进一步证明了TNFAIP3的作用，为变应性疾病的预防和治疗提供了新的思路。