P38MAPK信号传导通路在大鼠缺血再灌注中对MMP-9蛋白表达的影响

陈慧慧 黄丽丽

新生儿缺氧缺血性脑病在临床上较为高发，极易引起新生儿智能发育障碍、癫痫、脑性瘫痪甚至死亡，严重危害其中枢神经系统发育和生命健康安全［1］。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）是人体常见的一种金属蛋白酶，可对脑血管外基膜相关主要成分、降解细胞外基质成分进行攻击，进而损害血脑屏障的完整性，导致血脑屏障通透性增加，而使用P38 丝裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen activated protein kinase，P38 MAPK）特异抑制剂可明显减轻脑组织含水量［2-3］。P38MAPK信号传导主要参与脑部缺氧缺血后的炎症反应、脑细胞的增殖与分化、氧化应激等过程。阻断P38MAPK信号在大脑缺血再灌注中的过度激活，下调MMP-9过表达，可减轻急性脑梗死脑水肿症状［4］。本研究旨在观察P38MAPK 信号传导通路在大鼠缺血再灌注中对MMP-9蛋白表达的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物及试剂 清洁级雄性SD大鼠90只，体质量200～250（228.17±14.22）g，购自北京动物实验研究中心，动物使用许可证号：SYXK（京）2018-0013，于本院生物研究实验中心进行实验，在自然光照、相对湿度（64%±4%）、（21±4）℃室温下进食3天。免疫组化试剂盒购自上海容晖生物科技有限公司，兔抗大鼠P38MAPK多克隆抗体、P-P38多克隆抗体及MMP-9抗体均购自上海西唐生物科技有限公司，P38特异抑制剂购自北京伊塔生物科技有限公司，ELISA试剂盒、BCA试剂盒等购自上海美迪西生物医药股份有限公司，线栓（直径：0.26 mm）购自广州佳灵生物技术有限公司。

1.2 实验方法 （1）线栓制备：线栓切为3 cm小段，于5、10、15、20 mm处进行标记，便于实验中观察；取砂布打磨线成圆头形状，置于石蜡中融化，将打磨好约5 mm长度的鱼线插入石蜡中，3 s内取出，待晾干后备用。（2）建模及分组：采用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后，大鼠取仰卧位，常规备皮消毒，于大鼠颈部中央位置切开，钝性游离左颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，结扎颈部动脉的远端分支，沿着手术线对大鼠颈内动脉的颅外分支翼进行结扎，暂时夹闭左侧颈总动脉血管，并在其颈外动脉结扎位置近端行约0.2 mm的切口，之后导入制备好的线栓；沿着颈外动脉分叉部位的动脉血管轻轻推进线栓，直至线栓抵达标注的20 mm位置，遇到阻力即停止推进；一旦线栓到达颈外动脉的起始位置，便结扎其颈外动脉近心端动脉血管，松开颈内动脉血管夹，将多余的线栓剪除，其余线栓埋于大鼠皮下；最后，缝合切口并消毒。在大鼠动脉血管阻塞2 h后抽出线栓，将动脉血管阻塞端退出至分叉处，再次形成灌注后处死大鼠，取出大鼠脑部组织。根据大鼠大脑动脉阻断的不同模型分为对照组、缺血再灌注组和P38抑制剂组，每组各30例。其中，缺血再灌注组在制备SD大鼠脑动脉缺血再灌注模型前15 min，通过舌下静脉注射二甲基亚砜（南通英瑞达生物科技有限公司）400μg/kg；P38抑制剂组在制备SD大鼠脑动脉缺血再灌注模型前15 min，舌下静脉注射P38抑制剂（上海润诺生物科技有限公司）400μg/kg；对照组，切开大鼠皮肤，游离至大鼠动脉分叉处，未做插线处理，即刻缝合切口。三组均于手术24 h处死大鼠，取出脑部组织备用。（3）大鼠脑组织含水量测定：采用干湿质量法检测各组脑动脉缺血再灌注大鼠的脑组织含水量，脑组织含水量=（脑湿重-脑干重）/脑湿重×100%［5］。（4）脑梗死体积测定：采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色法，切取大鼠冠状脑片（间距2 mm），置于1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸盐缓冲液，避光染色30 min，之后置于多聚甲醛PBS溶液中固定保存；观察三组大鼠脑组织的染色情况，红色为正常脑组织，白色为梗死脑组织，拍照并计算脑梗死面积。（5）P38MAPK、MMP-9蛋白表达检测：采用免疫组织化学染色法，严格按照试剂盒说明要求操作，显微镜下观察细胞内P38MAPK、MMP-9蛋白的阳性表达情况。P38MAPK阳性，棕、黄褐色颗粒状；MMP-9阳性，棕黄色颗粒状；正常细胞染色为绿色［6］。

1.3 观察指标 三组大鼠的脑组织含水量、梗死体积及P38MAPK、MMP-9蛋白表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。计数资料以［n（%）］表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠的脑组织含水量及梗死体积比较 缺血再灌注组大鼠的脑组织含水量及梗死体积均明显高于P38抑制剂组、对照组（P<0.05），P38抑制剂组高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 三组大鼠的脑组织含水量及梗死体积比较［n=30，（±s）］

表1 三组大鼠的脑组织含水量及梗死体积比较［n=30，（±s）］

组别 脑组织含水量（%） 梗死体积（mm3）对照组 0 0缺血再灌注组 87.91±0.08 68.23±8.25 P38抑制剂组 68.59±0.13 39.69±6.30

2.2 三组大鼠的P38MAPK、MMP-9蛋白表达情况比较 缺血再灌注组大鼠的P38MAPK、MMP-9蛋白表达均明显高于P38抑制剂组、对照组，且P38抑制剂组P38MAPK、MMP-9蛋白表达高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2和图1-2。

表2 三组大鼠的P38MAPK、MMP-9蛋白表达情况比较［n=30，（±s）］

表2 三组大鼠的P38MAPK、MMP-9蛋白表达情况比较［n=30，（±s）］

组别 P38MAPK MMP-9对照组 2.72±0.73 18.83±5.91缺血再灌注组 10.45±2.76 59.05±6.59 P38抑制剂组 7.85±1.61 31.78±7.46

图1 缺血再灌注大鼠脑组织P38MAPK的表达（免疫组化法×400）

图2 缺血再灌注大鼠脑组织皮层区MMP-9的表达（免疫组化法×400）

3 讨论

大脑一旦发生缺氧缺血，脑部神经细胞会快速凋亡，导致神经元功能和结构出现异常，诱发缺血缺氧性脑损伤［7］。新生儿缺血缺氧性脑损伤受多种因素共同影响，会造成大脑组织后期神经系统发育障碍，甚至导致死亡［8］。临床上尚无针对缺氧缺血性脑损伤的有效干预措施，需要积极关注并预防。缺血再灌注时，通常会伴随大量黏附分子的过表达，特别是基质金属蛋白酶MMP-9的代谢产物，严重破坏脑毛细血管基底层，导致大鼠血脑屏障通透性遭到直接破坏［7-10］。脑组织中MMP-9属于明胶酶的一种类型，主要由血管内皮细胞、星形胶质细胞、海马神经元及小胶质细胞等分泌，在缺血缺氧性脑损伤病理情况下表达增高，细胞基质成分降解后极易破坏血脑屏障的完整性及通透性，引发并加重脑水肿症状［11］。P38MAPK是MAPK家族控制炎症反应最重要的成员，该信号通路会诱导大鼠血脑屏障通透性及脑含水量降低，大鼠缺血周边区脑组织MMP-9的表达明显下调［12-13］。

本研究结果显示，缺血再灌注组大鼠脑组织含水量、梗死体积均明显高于P38抑制剂组和对照组，且P38抑制剂组高于对照组，提示P38MAPK信号通路会加重SD大鼠缺血再灌注后脑水肿的发生风险，阻断P38MAPK通路能够明显降低脑动脉缺血再灌注大鼠血脑屏障破坏、创伤性脑水肿以及脑梗死体积，提高脑缺血再灌注损伤的临床疗效［14］。究其原因，发现P38MAPK参与了大鼠脑缺血再灌注后脑水肿的形成，机制可能为大鼠缺血再灌注后激活P38MAPK使缺血周边区脑组织MMP-9的表达上调，破坏血脑屏障通透性，进而导致了脑动脉缺血再灌注大鼠脑水肿症状的发生［15-16］。本研究结果显示，缺血再灌注组P38MAPK蛋白、MMP-9蛋白表达均明显高于P38抑制剂组和对照组，且P38抑制剂组P38MAPK蛋白、MMP-9蛋白表达高于对照组，说明抑制P38MAPK信号通路会明显降低脑动脉缺血再灌注大鼠P38MAPK蛋白、MMP-9蛋白水平，将因缺血再灌注所造成的血脑屏障损伤降低到最低限度，抑制缺血中心区神经元的兴奋性，通过对缺血缺氧性SD大鼠相关神经小胶质细胞的活性进行调节，缓解脑白质损伤，改善大鼠血脑屏障的通透性［17］。同时，抑制P38MAPK信号通路可对脑部黄嘌呤氧化酶、次黄嘌呤氧化酶相关活性通路进行抑制，减少脑部氧自由基含量，确保血脑屏障完整性稳定，进一步缓解脑水肿，保护大鼠脑神经细胞［18］。

综上所述，P38MAPK信号通路通过MMP-9的表达致使血脑屏障损伤，进而加重SD大鼠缺血再灌注后脑水肿的发生风险，阻断P38MAPK通路可下调大鼠创伤后MMP-9高表达，减轻血脑屏障破坏及创伤性脑水肿。