注射用克林霉素磷酸酯质量分析

李香荷 张冬 王强 王韵 田兰 高燕霞

(河北省药品医疗器械检验研究院，石家庄 050200)

克林霉素磷酸酯(clindamycin phosphate)为化学半合成的克林霉素前药，在体外无抗菌活性，进入机体后在碱性磷酸酯酶作用下水解为克林霉素而发挥抗菌活性[1]。克林霉素作用于敏感菌核糖体的50 S亚基，抑制细菌细胞的蛋白质合成，可作为对β-内酰胺类抗生素过敏时的替代药物[2]。临床主要用于治疗革兰阳性菌所致的呼吸道、耳鼻喉系统、皮肤软组织、泌尿系统等感染，还可用于厌氧菌引起的各种感染性疾病。不良反应主要为肾功能损害和血尿。

克林霉素磷酸酯注射液为美国法玛西亚普强公司(Pharmacia and Upjohn Company，即现在的辉瑞制药)研发，在1982年上市，其规格为2 mL:0.3 g。1994年，华北制药厂的仿制药被批准在国内上市。目前克林霉素磷酸酯制剂国产批准文号258个，剂型包括：胶囊剂、片剂、注射剂、凝胶剂、栓剂和阴道乳膏剂。注射用克林霉素磷酸酯批准文号103个，生产企业36家，规格有：0.15、0.25、0.3、0.4、0.45、0.5、0.6、0.75、0.9和1.2 g。

克林霉素磷酸酯原料药收载于《中国药典》2020版、USP44、EP11.0、BP2021和JP2021，注射用粉针剂各国药典均未收载。目前国内执行国家药品标准有：WS1-(X-358)-2003Z-2011-2017、WS1-(X-526)-2003Z-2010、YBH02202016、YBH00802012、YBH03602014、YBH02292015等。2021年，该品种被列为国家药品评价性抽验品种。共抽取142批次，涉及21个生产企业和38个批准文号，见表1。本文参考文献报道[3-9]，通过对国产注射用克林霉素磷酸酯的法定标准检验及探索性研究，以问题为导向，以提高药品质量为目标，对该品种药品进行全面质量评价。

表1 抽样情况表Tab.1 Table of samping

1 材料与方法

1.1 仪器

岛津离子阱飞行时间液质联用仪，安捷伦1260高效液相色谱仪；梅特勒XS125分析天平，XSPBM-3CA 显微镜，布鲁克D2 Phaser X射线衍射仪。

1.2 试药

克林霉素磷酸酯对照品(中检院提供，批号130486-201805，含量82.7%)；醋酸铵、甲醇、乙腈均为色谱纯(Fisher chemical)，其余试剂为分析纯。

142批次注射用克林霉素磷酸酯为2021年国家评价性抽验样品，规格分别为0.3、0.45、0.5、0.6、0.75和0.9 g/支。其中3个企业采用无菌分装工艺，共抽样19批，18个企业采用无菌冻干工艺，共抽样123批，调研收集到19个企业的原料和辅料，其对应的原料涉及6家企业。

2 试验方法

2.1 法定检验

按产品说明书上对应的执行标准，对142批次注射用克林霉素磷酸酯进行法定标准检验，主要评价项目为有关物质、水分、溶液的澄清度与颜色、酸度和含量测定。

2.2 HPLC法分析有关物质

色谱条件：色谱柱为岛津Shim-pack C18柱(规格：4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A：pH6.0磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢钾13.6 g，加水1000 mL使溶解，用0.45 mg/mL氢氧化钾溶液调节pH值至6.0)-乙腈(79:21，V/V)，流动相B：pH6.0磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢钾13.6 g，加水1000 mL使溶解，用0.45 mg/mL氢氧化钾溶液调节pH值至6.0)-乙腈(40:60，V/V)，先以流动相A等度洗脱，待克林霉素磷酸酯峰洗脱完毕后立即按表2线性梯度洗脱；流速：1.1 mL/min；柱温：35℃；进样量：20 μL；检测波长：210 nm。

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution program

2.3 LC-MS分析杂质结构

液相色谱条件：色谱柱为岛津Shim-pack C18柱(规格：4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A：0.036 mol/L乙酸铵溶液(用乙酸调节pH值至6.0)，流动相B：乙腈；按表3线性梯度洗脱；柱温35 ℃；流速：1.0 mL/min(柱后分流比为7:3，V/V)；进样体积20 μL。

表3 梯度洗脱程序Tab.3 Gradient elution program

质谱条件：离子源：ESI(+)；检测电压：1.54 kV；CDL温度：200℃；脱溶剂管温度：200℃。

2.4 HPLC含量测定

色谱条件：色谱柱为岛津Shim-pack C18柱(规格：4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：pH6.0磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢钾13.6 g，加水1000 mL使溶解，用0.45 mg/mL氢氧化钾溶液调节pH值至6.0)-乙腈(79:21，V/V)；柱温：35℃；流速：1.1 mL/min；进样体积20 μL；检测波长为210 nm。

3 结果与讨论

3.1 法定标准检验

依据法定标准检验，142批次抽样，全部符合规定，合格率为100%。对与产品质量密切相关的主要检验项目如有关物质、水分、溶液的澄清度与颜色、酸度和含量测定结果进行统计分析。

3.1.1 有关物质

现行法定标准中的有关物质检测方法及限度差异较大。比较其差异：WS1-(X-358)-2003Z-2011-2017、YBH03602014(B企业 0.3 g)和YBH02292015(D企业)标准，采用梯度系统(色谱系统相同)，YBH02202016(A企业)、WS1-(X-526)-2003Z-2010(B企业0.6 g)标准采用等度法。在限度方面，差异主要集中于对已知杂质的控制，国家药品标准WS1-(X-358)-2003Z-2011-2017仅控制林可霉素、克林霉素两个已知杂质；YBH02202016(A企业)控制了7个已知杂质；YBH02292015(D企业)控制了8个已知杂质；YBH03602014(B企业0.3 g)控制了4个已知杂质，国家药品标准WS1-(X-526)-2003Z-2010(B企业0.6g)未控制已知杂质，仅控制了单杂和总杂。

139批次中均未检出林可霉素，克林霉素含量为0～0.6%，其他单杂含量为0.01%～1.4%，其他总杂含量为0.1%～3.6%；不同工艺产品之间杂质差异较大(图1)，其中企业A、B和C 3家无菌分装产品，克林霉素含量均值分别为0.015%、0.10%和0.08%、其他单杂含量均值分别为0.03%、0.11%和0.38%，其他总杂含量均值分别为0.11%、0.30%和0.62%；M企业(冻干工艺)产品杂质含量最高，克林霉素含量为0.6%、其他单杂含量为1.2%，其他总杂含量为3.1%。采用无菌分装的3家企业产品无论单个杂质还是杂质总量均远低于冻干工艺产品。

图1 有关物质检验结果Fig.1 The standard test results for related substances

同一生产企业不同批次产品之间亦存在一定的差异。统计同企业3批次以上的产品结果，其他总杂含量差异最大的产品来自A、B、O、H和T企业，其中A和B的产品(无菌分装品)，由于其杂质含量本身较低，使得批间的RSD相对较大；O、H和T企业产品(无菌冻干品)，由于稳定性较差，其杂质含量与贮存时间呈正相关(P＜0.05)，贮存时间的差异导致批间杂质含量差异较大，使得RSD值偏大。

此外，现行质控标准的差异使得测定结果可比性不强。从测定结果看，不同分析方法造成杂质总量的极差可高达3.5%，说明该品种有关物质控制方法亟待规范统一。

3.1.2 水分

各现行标准中的水分限度不统一。国家药品标准WS1-(X-358)-2003Z-2011-2017和YBH03602014(B企业)均规定“水分不得过1.5%”，YBH02202016(A企业)规定“水分不得过6.0%”，国家药品标准WS1-(X-526)-2003Z-2010(B企业0.6g)规定“水分不得过1.3%”。

142批次样品采用费休氏法测定水分，结果为0.2%～1.4%，均值为0.77%，企业间水分结果差异较大(图2)，其中，A、B、C、K和R企业5家的产品水分含量均值较低，分别为0.4%、0.4%、0.5%、0.3%和0.3%；I、O、P和F企业4家的产品水分值较高，分别为1.2%、1.1%、1.2%和1.1%。3家无菌分装工艺的产品水分含量明显低于采用无菌冻干工艺的产品；不同企业冻干工艺产品的水分含量差异较大，其中E、O、S和T企业产品的批间差异较大，反映该企业冻干工艺稳定性有待提高。

图2 水分检测结果Fig.2 The result of moisture

3.1.3 溶液的澄清度与颜色

冻干工艺产品的检测浓度为0.2 g/mL，无菌分装产品的检测浓度为0.04 g/mL；142批次产品检验结果均符合规定，但检测浓度的差异使得其结果不完全具有可比性。

检验结果显示，137批次产品澄清，5批次澄清度略显浑浊，但浅于1号浊度标准液；140批次产品的溶液颜色为无色，S企业和J企业各1批产品颜色稍深，介于黄色1号与2号之间。

3.1.4 酸度

按法定标准检验均符合规定。其中，123批次无菌冻干产品的pH值在6.2～6.8之间(标准规定pH值5.0～7.0)，19批次无菌分装产品的pH值在3.7～4.4之间(标准规定pH值3.5～4.5)，同一生产企业不同批次的酸度值均较为接近。

3.1.5 含量测定

按法定标准检验142批次样品均符合规定。虽然不同标准中含量的限度有所差异，但从所有样品的含量测定结果，按无水物计分布于76.4%～85.8%之间，均值为80.6%，极差9.4% ；按平均装量计，含克林霉素为标示量的94.0%～106.2%，均值为98.6%，极差12.2%；未发现低限投料的问题。

对不同生产企业3批次以上产品数据进行分析，批间含量差异最大的为B企业，变异系数为1.8%(按无水物计)和3.5%(按平均装量计)，批间含量差异最小的为O企业，变异系数为0.6%(按无水物计)和0.5%(按平均装量计)。

3.2 探索性研究

3.2.1 杂质谱分析

采用新建立的杂质谱分析方法共检出13个杂质，应用LC-IT-TOF/MS技术，结合克林霉素磷酸酯EP系统适用性对照品、杂质F(林可霉素2-磷酸酯)、杂质G(2，4-磷酯酰林可霉素)、杂质B(克林霉素B磷酸酯)对照品，中国药品检验研究院提供的杂质A(林可霉素)和杂质E(克林霉素)对照品，参考国外药典，确证样品中11个杂质的结构。杂质1为林可霉素2-磷酸酯，杂质2为2，4-磷酯酰林可霉素，杂质3为林可霉素，杂质4为克林霉素2，4-二磷酸酯，杂质5为克林霉素B磷酸酯，杂质6为克林霉素2，3-二磷酸酯，杂质7为7-表克林霉素磷酸酯，杂质8为克林霉素(2R-顺式)-非对映异构体2磷酸盐，杂质9为3′(6′)-去氢克林霉素磷酸酯，杂质10为克林霉素，杂质11为克林霉素焦磷酸酯。各杂质结构见表4。

表4 各杂质推定结构及来源分析Tab.4 Structure and source analysis of peaks of related substances

续表4

利用强制降解试验结合LC-MS/ MS质谱分析，探讨产品中诸杂质的来源。无菌冻干制剂中杂质F和杂质B的含量远高于原料，尤其是随着贮存时间的延长，两个杂质含量显著增加，提示其为贮存中的主要降解杂质；克林霉素磷酸酯对酸较稳定，在热、碱、氧化和紫外条件下易产生杂质F、G、E。

3.2.2 有关物质测定结果

比较EP11.0(BP2021与EP11.0方法及限度一致)、USP44和《中国药典》2020年版克林霉素磷酸酯原料的有关物质方法，初步认为EP11.0收载的克林霉素磷酸酯有关物质的分析方法较理想，以此为基础对其梯度洗脱程序进行了优化(图3)，全部已知杂质均可以良好分离。

图3 优化的有关物质高效液相色谱图Fig.3 Optimized chromatogram of the related substances

按优化方法检验，142批次注射用粉针剂中，杂质F在0.04%～1.5%之间，杂质G在0.03%～0.4%之间，杂质B在0.1%～1.8%之间，杂质L在0.02%～0.6%之间，杂质E在0.03%～0.8%之间，其他单一杂质在0.1%～0.3%之间，杂质总和在0.6%～5.5%之间。

参照EP11.0、克林霉素磷酸酯原研企业的限度，建议注射用克林霉素磷酸酯有关物质限度为：杂质F(相对保留时间为0.15)不得过3.0%、杂质G(相对保留时间为0.20)不得过0.5%，杂质B(相对保留时间0.45为)不得过1.5%，杂质L(相对保留时间为0.63)不得过0.8%、杂质E(相对保留时间为1.7)不得过1.5%，其他单一杂质不得过0.5%，杂质总和不得过6.0%。142批次注射用克林霉素磷酸酯中，仅3批次近效期的冷冻干燥产品(分别来自H、T和F企业)达不到上述要求(图4)。

图4 有关物质检测结果单值图Fig.4 The results of related substances

3.2.3 含量测定方法的改进

法定标准中的含量测定方法均采用C8色谱系统，但流动相系统与有关物质测定的流动相完全不同，结果杂质A(相对保留时间为0.97)与克林霉素磷酸酯主峰之间与不能达到完全分离(图5)，采用上述优化的有关物质分析方法测定克林霉素磷酸酯的含量，诸杂质及辅料和溶剂均不干扰测定。142批次样品按优化后色谱系统检验，结果与法定标准检验结果相比，差异较小(图6)，但结果的稳定性更好。

图5 法定标准典型色谱图Fig.5 The typical chromatogram with legal standard

图6 含量测定结果比较Fig.6 Comparison chart of assay results

3.2.4 原料晶型比较

目前国内克林霉素磷酸酯原料药生产厂家为10个，调研共收集到其中6个企业(A1～A6企业)的原料。采用显微镜观察法对6个企业原料晶型进行测定，结果 A1企业的晶粒规整，有六边形板状和不规整状，细晶少，A2、A3和A4企业的晶粒为长方体板状，A5和A6企业的晶粒较小，且晶体粒径大小不一(图7)。

图7 克林霉素磷酸酯原料晶型图Fig.7 The pictures of clindamycin phosphate

采用X-粉末衍射法对6家企业的原料进行测定，发现A6企业的原料X-粉末衍射图峰形和其他5家企业有一定差异。提示不同原料药企业的结晶工艺存在差异。3家采用无菌分装工艺生产的企业所用原料均来自A1和A6企业；采用冻干工艺的产品原料来自其他4家原料企业，有的制剂企业未固定原料供应商(使用2～3家供应商的原料)。由于结晶工艺可直接影响原料的杂质谱，采用不同供应商的原料药生产制剂，可能是导致制剂杂质谱变异的原因之一。

评价结果显示，采用无菌分装工艺生产的制剂，从杂质控制角度明显优于冷冻干燥工艺制剂。但另一方面，从注射剂无菌保障水平角度，冷冻干燥工艺较无菌分装工艺在制剂过程更易控制产品的污染。对该类产品生产工艺的评价将是国内仿制药一致性评价/再评价的关键。