畜禽肉中源成分检测技术研究进展

张亚丽，牛立沙，黄云霞，孟志娟，张 岩，范素芳，李 强

（河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050227）

畜禽肉种类繁多，蛋白质含量较高，营养价值丰富，同时富含B族维生素和不饱和脂肪酸，是人体蛋白质和微量元素的重要来源。2013年我国肉类年产量达8 536 万t，成为全球第一的肉制品生产大国。畜禽肉及其制品在我国占据很大的消费市场，在肉制品的高需求下，也滋生出许多畜禽肉制品的掺假问题，引起消费者的高度重视。全球的肉制品安全问题在2013年“马肉风波”中便引起高度重视。用低价肉或非肉成分经处理后冒充高价肉，用非原产地产品冒充原产地产品等，在获得暴利的同时严重侵害消费者权益。

为了严厉打击肉制品掺假事件，各个国家和地区在不同程度上规定了肉制品的标识，包含全部成分及其净含量。欧盟定量成分声明详细规定了肉制品所有成分及其净含量的计算方法，还规定了蛋白和脂肪等成分需要单独列出以及其最高含量。如猪肉脂肪最高限量为30%、结缔组织蛋白限量为25%，鸟类和兔肉的脂肪限量为15%、结缔组织蛋白限量为10%，其他哺乳动物纯肉及其混合肉制品脂肪含量和结缔组织蛋白限量为25%。我国已于2011年发布GB 7718—2011《食品安全国家标准 预包装食品标签通则》，作为食品检验的依据。为保障相关系列规定的有效实施，需要科学的检测方法做支撑，畜禽肉源成分检测技术的发展显得至关重要。因此，建立肉制品源成分定性及定量方法对检测肉制品质量、辨别肉质真伪具有重要意义。动物源性成分检测技术的研究对象为食品中的蛋白质、DNA、脂肪酸等，关键技术手段主要包括酶联免疫、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、电泳、色谱、生物传感分析及新兴的蛋白组学-质谱技术，以不同的分子结构、DNA序列或特异性组成等作为分析依据。本文针对畜禽肉源成分检测技术的研究进展及其应用进行综述，着重介绍不同肉类相互掺假问题以及不同肉类的分析和检测手段，总结常用方法的优缺点，并对检测技术的发展趋势进行展望。

1 基于蛋白质的检测方法

蛋白质是组成生命物质的主要成分之一，参与生物组织构成，维持机体正常新陈代谢，为生命活动提供能量。蛋白质的氨基酸序列具有种内相似性和种间特异性的特点，蛋白质因其特殊结构，常被用于不同物种和不同物质的鉴别，基于蛋白质的检测方法逐渐成为一种非常有效的鉴假手段。目前有很多用于鉴别肉制品掺假的技术及方法，主要是利用蛋白质的特性进行鉴别。例如，以蛋白质条带特征为基础的凝胶电泳分析法、利用蛋白质直接酶解原理的免疫分析法及直接使用蛋白质溶剂提取沉淀的色谱分析方法等。王百龙等利用蛋白质电泳法发现，短尾海蛾鱼蛋白质比飞海蛾鱼少1 条条带，为2 种鱼类的种间鉴别提供了新方法。凝胶电泳分析法以双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）的分离蛋白效果最优。Montowska等利用2-DE法检测在生肉中观察到的肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）同种型表达的种间差异是否保留在肉制品中，通过2-DE分析肉糜混合物中的MLC（16 种变体）、法兰克福香肠和由牛肉、猪肉、鸡肉、火鸡肉、鸭肉和鹅肉制成的香肠（15 种产品）中的MLC，实现对牛肉、猪肉、鸡肉、火鸡肉、鸭肉和鹅肉6 种肉源的物种鉴别，发现在一级结构上存在较大差异的一些蛋白质，可以用来作为肉制品认证的标记。胡文彦等利用热处理技术加速蛋白质酶解，从牛肉、鸡肉、鸭肉、猪肉、羊肉5 种肉类中筛选出14 种特异性多肽标记物，适用于生肉和熟肉的掺假鉴别，建立了基于物种特异性多肽标记物的无标记定量方法，省略了合成多肽标准品步骤。此方法对生肉和肉制品源性检测的测定限为1%，检测可在2 d内完成。

对于不同物种的检测，电泳法是将不同的可溶蛋白进行分离，这些不同的指示蛋白产生独特的电泳条带，根据电泳条带鉴别物种之间的差异。但是当物种混杂多样时，例如肉糜掺假检测实验，混合蛋白质的指示条带相对复杂，单一的电泳法难以达到鉴别要求。因此需要电泳法与其他方法联合检测，从而达到检测含有不同物种混合样品的目的。Sotelo等通过深入研究十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）技术，通过对电泳法的改进，发明了一种有效鉴别海产品中鱼类的方法。Hsieh等基于SDS-PAGE图谱的特异性，对红鲷鱼进行深入研究，开发了一种用于鉴定其珍贵品种、替代品及劣质品的方法。Aristoy等基于等电聚焦电泳技术，针对混合碎肉中蛋白质图谱进行分析，发明了一种鉴别技术，成功对牛肉、猪肉和火鸡肉进行了区分。Simó等基于毛细管电泳-质谱技术，利用蛋白质中溶菌酶成分，提出了一种新的鉴别技术，可以实现鸡肉和火鸡肉的成功鉴别。

基于蛋白质大分子结构的免疫分析方法具有灵敏度高、操作简单、高通量等优点，可以实现大批量样品的快速检测。免疫学方法有试管沉淀法、琼脂扩散法、对流免疫电泳法、放射免疫法及酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法等，其中ELISA应用最为广泛。Macedo-Silva等制备牛肉、鸡肉、猪肉、马肉中蛋白的抗血清，建立ELISA方法，用来鉴别汉堡中可能掺杂的廉价肉类成分，灵敏度达0.6%。Chen、Liu Lihua等采用单克隆抗体的ELISA技术，针对热稳定肌肉蛋白进行分析，对生鲜猪肉、牛肉、羊肉等肉混合物中猪肉含量和饲料中的痕量猪肉进行鉴定，结果显示，多种来源的肉类混合物中猪肉的检测限为0.05%～0.50%。

不同物种的肉制品中蛋白质、氨基酸等组成也存在差异，因此通过色谱定性、定量分析等方法也可以对肉制品的掺假情况进行鉴定。Ashoor等提出了一种新的液相色谱方法，能够定性检测多种肉类成分，并且能够定量检测鸡肉-火鸡肉混合物成分。Schonherr提出了一种能够对肉类成分进行定性鉴别的方法，该方法主要利用氨基酸二肽谱分析技术，结合高效液相色谱法，对肉制品进行定性分析，可以实现对猪肉、羊肉、鸡肉或牛肉的准确检测。

2 基于DNA序列特异性的鉴别技术

DNA是一种呈双螺旋式结构、广泛分布于细胞核、线粒体和叶绿体等细胞器中的生物分子，携带着生命体中最核心的遗传信息，可以被用于肉制品鉴别。基于DNA序列特异性的分子生物学技术，因以动物种属间遗传信息的差异作为不同品种肉制品鉴别的检测靶点而被广泛应用。DNA分子和蛋白质具有种内相似性和种间特异性的特点。相比蛋白质，DNA克服了蛋白质遇热变性的缺点，虽然其在加工过程中可能会造成一定程度的降解，但提取到的小片段DNA仍可被用于PCR分析。另外，DNA内部还存在非编码区，因而能够提供更多的遗传信息用于鉴别，而且其还具有特异性高、灵敏度高、不受组织类别限制等诸多优点，在亲缘关系较近的物种检测时具有较高的分辨能力。通过对比基因组DNA或线粒体DNA序列差异，进而进行物种鉴定和定性分析是当前DNA分析法中最常使用的技术手段。

DNA杂交法是较早用于物种鉴别的DNA检测方法，该方法的主要原理是DNA在受热变性情况下打开双链，温度降低后，进行碱基互补配对，又恢复双链状态。DNA杂交过程必须使用探针，常使用纯度较高的基因组片段，用放射性同位素标记作为基因探针。DNA探针技术又称作核酸杂交技术，放射标记的基因在杂交表达过程中产生放射信号，根据信号有无可以进行动物源性成分的鉴别。例如，DNA杂交法应用于加工后猪肉和牛肉的鉴别上，效果非常显著，识别率高。但后来这种方法在实际应用推广过程中显现出一些弊端，如实验具有放射性、操作时间长，杂交实验成功的前提通常对DNA的纯度要求特别高，针对不同加工方式的肉类，腌制、熏制等生产加工工艺不同，对肉类鉴别实验产生的干扰较大等。随后出现的新型PCR技术，逐渐取代传统DNA杂交方法，成为利用DNA特征序列来鉴别动物源性成分的主要技术手段。目前的主要技术手段集中于以PCR为基础的各类分析方法，如PCR-电泳技术、PCR-测序技术、PCR-限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，PCR-RELP）技术、随机引物扩增技术、实时荧光PCR技术、数字PCR技术等。PCR技术的主要工作原理是通过DNA序列扩增技术将检测样品中单拷贝的DNA片段达到指数倍扩增，将其应用于动物源性成分检测技术后，极大提升了检测灵敏度和结果可靠性。徐岩等开发出一种基于PCR-RFLP鉴别梅花鹿茸和马鹿茸的快速检测方法。Wang Lijuan等扩大推广PCR-RFLP技术的应用，结合荧光标记技术，实现了对奶牛中脂肪含量和蛋白质含量的测定，该技术特点是将12S rRNA通用上游引物5’端标记FAM染料，下游通用引物5’端标记HEX染料，配合I和I 2 种限制性内切酶，通过荧光强度和条带长度双重信号判定结果，提高了RFLP法的灵敏度和准确性，并提供了快速鉴定食品中DNA成分来源的新途径。Kesmen等提出一种基于PCR技术检测熟香肠中低含量猪、马、驴源性成分的方法，向牛肉馅、羊肉馅中添加0.0%、0.1%、0.5%、1.0%、5.0%马肉、驴肉和猪肉进行实验，结果表明，该方法的灵敏度可达0.1%。Ilhak等向牛肉、绵羊肉、山羊肉中添加5.0%、2.5%、1.0%、0.5%、0.1%猪肉、马肉、猫肉、狗肉进行PCR扩增，得到439、322、274、271、225、212、157 bp的片段，增加循环数到35，该方法的灵敏度达0.1%。Behrens等提出一种基于多重PCR技术鉴别鸡肉、火鸡肉、牛肉、猪肉、山羊肉、绵羊肉、驴肉和马肉的方法，结果表明，该方法在加热和加工肉制品中的检出限达1%。Bai Weibin等通过混合鸡肉、牛肉、猪肉和马肉多重引物，实现了在单一PCR反应中对物种特异性DNA的鉴别，检测限达0.5 g/kg。

实时荧光定量PCR技术可以被分为两大类。第1类被称为Man实时荧光定量PCR，其原理是利用双荧光标记探针的荧光基团解离产生荧光强度变化，进而进行成分鉴别；第2类是利用染料分子插入双链DNA产生荧光变化的SYBR Green实时荧光定量PCR。Druml等提出一种基于荧光PCR技术的检测方法，用于检测肉类产品中鹿肉的掺假含量，双重荧光PCR法检测结果显示，野生肉制品中可能含有的20 种动物源成分和43 种植物源成分没有交叉反应；双重荧光PCR检测黇鹿肉和马鹿肉检出限为0.5%，梅花鹿肉为0.1%；而且通常含量的测定值与实际鹿肉含量误差低于25%，相对标准偏差一般低于10%，说明该测定方法在重复性和精确性上表现良好。López-Andreo等提出一种基于SYBR Green实时荧光定量PCR的方法，用于鉴别牛肉、猪肉、马肉和袋鼠肉，该方法的最低检测限可达0.04 pg DNA，可以有效应用于检测实验室人工掺杂的肉制品，但之后进行的二重PCR检测灵敏度有所降低。Soares等基于SYBR Green实时荧光PCR技术开发了一种检测方法，可以实现对禽肉制品中掺杂的猪肉成分的定量分析。

数字PCR技术是近年来发展出的一种新型PCR技术，是对传统PCR的一次改良，改进了传统PCR低灵敏度的劣势，通过对荧光信号进行分析，进而对肉类成分进行准确定性和定量。新型数字PCR技术可以实现对不同物种的识别，如同时分析肉糜中的牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉等；同时可以实现对食品来源、产地进行区分，如对新疆牛羊肉和冀中牛羊肉的鉴别。通过数字PCR技术建立不同的基因库，与旧库对比，新库统计基因库的搜索识别功能越来越强大，应用会越来越广，通过数字PCR技术对肉类产地的区分能为肉类源成分的溯源分析提供依据。

环介导等温扩增技术，是采用恒定温度条件进行核酸片段的扩增。柳海宾等利用环介导等温扩增技术结合免疫层析试纸法对羊肉中的鸭肉成分进行鉴别，不需要复杂的仪器设备，且仅需5 min即可出现可视化反应，相比于环介导等温扩增结合电泳法，避免了培养专业操作者的成本，而且节约时间，相比于环介导等温扩增技术结合荧光法，避免了加入荧光染料对样品的干扰，排除了干扰因素，优点显著。

3 基于脂肪酸的检测方法

脂肪酸由饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸组成，脂肪酸组成是评判禽畜肉营养价值高低的重要指标。禽畜肉制品的掺假问题不仅包括肉成分的代替、肉来源的掺假，还包括肉类加工处理方式的改变。脂肪酸的含量和组成会因为食品加工方式的不同产生变化，脂肪酸含量也是影响肉制品风味和口感的重要因素。

禽畜肉中脂肪酸的检测技术常常为色谱-质谱技术联用，侯召华等基于脂肪酸检测，结合气相色谱-质谱分析，对不同加工处理方式的猪肉进行研究，对比冷鲜里脊肉和真空冷冻干燥里脊肉中脂肪酸的差异。赵佳等对猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉5 种肉类，选取腿、胸、内脏等不同部位的脂肪酸进行检测分析，发现猪肉中饱和脂肪酸含量最低，牛羊肉中饱和脂肪酸含量较高。皮立等建立一种基于脂肪酸检测的气相色谱-质谱技术，可以用于区分欧拉羊、高原羊和小尾寒羊。李朝阳等结合气相色谱-质谱技术分析不同部位狮白鹅的脂肪酸含量，包括肝脏、前胸、腿部、腹部和血液，研究发现，油酸在腹部含量最高，花生四烯酸在肝脏含量最高，腹部含量为零。

由于脂肪酸的种类复杂，一种肉类可能包含几十种脂肪酸，只有特定的一种或几种脂肪酸可以区别某种禽畜肉，脂肪酸检测的大部分结果显示，脂肪酸组成差异与肉质类别间的相关性无统计学意义，因此基于脂肪酸检测来区分不同物种的方法开发有一定的难度，推广及应用的范围相对较小。脂肪酸组分与含量的差异不仅影响风味，也是控制食品质量与检测食品掺假的有效途径，通过对不同部位脂肪酸的检测分析，达到品质控制、建立更合理的膳食结构的目的。

4 色谱和质谱技术

色谱包括液相色谱和气相色谱，原理是利用样品的分子质量不同、疏水性和电负性，将目标物分开，而质谱可根据质荷比确定分子的种类，因而色谱-质谱联用技术也广泛应用于有机物和多肽的定性及定量分析。

色谱技术在胶类药材上的应用很普遍，随着现代生活水平的提高，人们对于保健食品的要求也逐渐提高，阿胶的原材料之一是驴皮，我国每年驴养殖量远低于马养殖量，用马皮掺假驴皮制胶的现象屡禁不止，制胶过程中的高温加工处理严重破坏了驴皮中的DNA和蛋白质，所以PCR技术和蛋白质技术无法实现对驴皮和马皮的鉴别，高效液相色谱技术可以实现对阿胶中驴皮成分的鉴别，促进了对阿胶质量品质的把关，有助于规范保健品市场。

Chou等选取15 种生熟肉品，来源于牛、猪、山羊、鹿、马、鸡、鸭、鸵鸟、鲑鱼、鳕鱼、虾、螃蟹、扇贝、牛蛙、短吻鳄等，采用高效液相色谱技术和电化学检测技术测定，物种特异性标记显示出可重复的峰值保留时间，变异系数不高于6%。Wissiack等根据离子电负性对阴离子进行色谱选择，选取二极管阵列检测器扫描416 nm波长处的特征峰，实现了对牛肉、羊肉或猪肉血红蛋白的定量分析，实验证明，对于混合肉样中含量大于10%的成分能实现快速检测，但由于共洗脱导致牛肉与羊肉较难区分。Giaretta等利用液相色谱法检测生牛肉汉堡中的肌红蛋白，来定量分析猪源性成分含量。由于实验过程中需要将样品与亚硝酸钠作用，将不稳定的肌红蛋白（氧合肌红蛋白和脱氧肌红蛋白）转化为较稳定的高铁肌红蛋白，因此步骤繁琐，耗时较长，最低检测限可达5%。肉制品中蛋白质含量变化较大、干扰因素多，致使该类技术的灵敏度较低，容易产生假阳性结果。

现阶段，将鸟枪法和质谱法相结合实现禽畜肉源成分鉴别成为新的研究热点。Bargen等采用该方法鉴别牛肉中的马肉和猪肉成分，以鸡肉、羊肉和牛肉为阴性对照，筛选出马肉和猪肉的特征肽，并确定牛肉中马肉和猪肉的最低检出限为0.55%。Montowska等采用电喷雾解吸电离质谱技术与液滴萃取表面分析质谱技术检测牛肉、猪肉、马肉、鸡肉、火鸡肉5 种肉类骨骼肌蛋白，根据信噪比和多元分析法成功鉴别了5 种肉类成分的特征肽。

5 结 语

随着人们生活水平的提高，消费者对畜禽肉制品掺假的问题越来越重视，针对不同肉的掺假鉴别技术亟需发展。现阶段，针对不同禽畜肉掺假问题的检测技术，最常见的是基于蛋白质、DNA、脂肪酸的检测技术和色谱-质谱技术。基于蛋白质的肉类掺假技术操作相对简单、灵敏度高，可以用于批量样品的检测，但只适用于已知具有特异性抗体的肉类检测研究，实验容易受到蛋白质易变性的影响。基于脂肪酸的检测技术常与色谱-质谱联合使用，检测效率高，不同肉的脂肪酸含量存在明显差异，实验对样品的处理较为简单，但由于脂肪酸种类较多，对于多种混杂样品的检测，寻找可以区分不同肉类的脂肪酸较为困难，检测准确度不高，容易出现假阳性。基于DNA序列特异性的检测技术是当前被广泛应用在肉制品掺假鉴别中的检测方法，这种检测技术的精确度高、重复性好、检测效率高，适用于样品的批量检测，可以对掺假成分进行定量测定，为掺假鉴别提供较为准确的数据支持，但是检测成本相对较高，需要的仪器耗材也相对昂贵。

本文讨论检测畜禽肉及其制品掺假的主要技术，并分析近几年研究较多的几种检测方法，归纳总结各类检测方法的优缺点。目前，我国已经发布了一些肉类真实性鉴别的国家标准，如GB/T 35024—2018《常见畜禽动物成分检测方法 液相芯片法》、GB/T 35917—2018《常见动物源性成分快速测定 膜芯片法》、GB/T 38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法》、NY/T 3309—2018《肉类源性成分鉴定 实时荧光定性PCR 法》、HS/T 13—2006《牛、羊、鹿源性成分鉴定方法 实时荧光PCR方法》、SB/T 10923—2012《肉及肉制品中动物源性成分的测定 实时荧光PCR法》、SN/T 2557—2010《畜肉食品中牛成分定性检测方法 实时荧光PCR法》等，禽畜肉制品的掺假检测定性技术研究已经相对成熟，但是对于掺假成分的准确定量问题还未找到较为理想的检测方法。对于肉制品的溯源判定，如生产污染和后期添加的判断等问题也需要开发新方法，因此未来的科研方向为研发更为精准的定量检测技术，实现掺假成分的痕量检测。