枸杞黄酮提取方法的优化以及不同生态因子与枸杞黄酮相关性研究

王鹏波，谢晓蓉 ，代云云，刘建书，陈 梅，张 霞，裴 栋, ，邸多隆

（1.甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州 730000；2.中国科学院兰州化学物理研究所，中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室，甘肃兰州 730000；3.陕西功能食品工程中心有限公司，陕西西安 710000）

枸杞（Lycium barbarumL.）是茄科植物宁夏枸杞的干燥成熟果实，具有补肝肾，益精血，明目的功效[1]。枸杞的主要化学成分有黄酮类、多糖类、氨基酸、维生素、生物碱类和矿物元素等[2-4]。现代研究表明，枸杞黄酮是其发挥抗氧化、抗衰老、治疗心脑血管疾病等药理活性的主要物质基础[5-8]。因此，从枸杞中高效提取枸杞黄酮并应用于食品和药品领域具有重要意义。目前常见的提取枸杞黄酮的方法有溶剂浸提法、回流提取法、超声提取法、微波辅助法[9-11]等。传统的溶剂浸提法和回流提取法成本低，适用于工业化大生产，但提取效率低，提取物杂质多[12]；微波辅助法、超声法省时、提取率高，已广泛应用于医药工业中，但选择性差，含量低[13]。

高速剪切技术（High-speed Shear Dispersing Emulsifier，HSDE）（又称闪提法）作为近年发展起来的一种均质化技术，可高效、快速、低能耗地从生物质样品中提高有效成分，已被应用到药物研究相关的诸多领域[14-15]。低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents，DESs）是一种新型的绿色溶剂，在提取分离天然产物中逐渐得到重视[16-17]。与传统有机溶剂提取方法相比，新型绿色的低共熔溶剂具有低污染、提取率高和可回收利用等优点，近年来，已广泛应用于黄酮类物质的提取[18-20]，并且明显提高了黄酮类活性物质的提取量。

本研究首次将高速剪切提取技术和DESs提取方法进行组合用于枸杞黄酮的提取，分别比较了回流提取法、高速剪切辅助乙醇提取法、超声辅助DESs提取法对枸杞总黄酮提取量的影响，并对高速剪切辅助DESs的提取条件进行优化，筛选出对枸杞黄酮的最佳提取条件。本研究结果对于枸杞黄酮和中药中黄酮类化合物的提取提供了新方法，并在此基础上采用SIMCA 14.1软件分析不同产区生态因子和枸杞黄酮的相关性，为枸杞资源的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枸杞样品 来源于内蒙古包头，经甘肃中医药大学谢晓蓉教授鉴定为茄科植物宁夏枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果实，粉碎过50目筛，避光、保存备用；芦丁对照品 纯度≧98%，批号1000800-171130，济宁天之蓝生物科技有限公司；氯化胆碱分析纯，安耐吉化学试剂公司；乙二醇 分析纯，利安隆博华（天津）医药化学有限公司。

XQ100克型多功能高速粉碎机 上海广沙工贸有限公司；T25高速剪切机 IKA公司；BSA224SCW型电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；KQ-250DB型数控超声清洗机 昆山超声仪器有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司；H1650型医用离心机长沙湘仪仪器有限公司；TI-19系列双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取方法的初步筛选

1.2.1.1 乙醇回流法 参照文献[21]中最佳的提取方法进行实验测定，具体操作如下：精密称取枸杞样品约3.0 g，以70%乙醇、料液比为1:15 g/mL回流提取2次，每次1.5 h，放至室温，过滤，合并滤液，转移至100.0 mL容量瓶中，以同浓度乙醇定容，摇匀。在15000 r/min离心机中离心20 min，取上清液即得总黄酮提取液I。

1.2.1.2 高速剪切辅助乙醇提取法 参照文献[22]中最佳的提取方法进行实验测定，具体操作如下：精密称取枸杞样品约3.0 g，以70%乙醇、料液比为1:20 g/mL，室温下在高速剪切机18000 r/min条件下处理5 min后，过滤，滤液转移至100.0 mL容量瓶中，以同浓度乙醇定容，摇匀在15000 r/min离心机中离心20 min，取上清液即得总黄酮提取液II。

1.2.1.3 超声辅助DES提取法 参照文献[23]中最佳的提取方法进行实验测定，具体操作如下：精密称取枸杞样品约3.0 g，以DESs（氯化胆碱:乙二醇，摩尔比1:2）、料液比为1:20 g/mL，室温下在超声清洗器（功率100 W）处理30 min后，过滤，滤液转移至100 mL容量瓶中，以同浓度乙醇定容，摇匀在15000 r/min离心机中离心20 min，取上清液即得总黄酮提取液III。

1.2.1.4 高速剪切辅助DES提取法 参考本课题组之前相关研究[24]，精密称取枸杞样品约3.0 g，以DESs（氯化胆碱:乙二醇，摩尔比 1:2）、料液比为1:20 g/mL，室温下在高速剪切机10000 r/min条件下处理5 min后，过滤，滤液转移至100.0 mL容量瓶中，以同浓度乙醇定容，摇匀在15000 r/min离心机中离心20 min，取上清液即得总黄酮提取液IV。

1.2.1.5 枸杞黄酮含量测定方法 参照文献[25]进行测定，具体操作如下：精密吸取上述制备的不同提取方法所得样品溶液1.0 mL，置于10.0 mL容量瓶，各加0.5 mL 5% NaNO2水溶液，摇匀静置6 min；再各加入 0.5 mL 10% Al（NO3）3水溶液，摇匀静置6 min；继续加入4.0 mL 4% NaOH水溶液，用70%乙醇定容，摇匀后静置15 min。精密吸取水2.0 mL，同法制备以不加芦丁对照品的空白溶液为参比溶液。分别取参比溶液、样品溶液，于紫外可见光分光光度计上在吸收波长510 nm处测定。

根据线性回归方程计算，求出吸取样品溶液中的总黄酮含量。枸杞中总黄酮的含量按下式计算：

本研究通过前瞻性队列研究，在 435例乙型肝炎病毒感染患者中进一步探讨和验证了 2型糖尿病与乙型肝炎病毒相关肝癌发病的关系，并提供了 2型糖尿病与乙型肝炎病毒相关肝癌发病风险的前瞻性研究证据。但本研究也存在一定的局限性，如没有考虑糖尿病病程、糖尿病用药、抗病毒治疗等因素对研究结果的影响，因此尚需纳入相关因素进一步开展更大样本量的研究。总之，在本队列人群中，2型糖尿病和乙型肝炎病毒相关肝癌发病有关，2型糖尿病增加了乙型肝炎病毒感染患者的肝癌发病风险。

式中：w为黄酮类化合物的含量，mg/g；c为样品液所测吸光值对应的标准曲线上的浓度，mg/mL；V1为供试品溶液的体积，mL；V2为定容后待测样品液体积，mL；V3为测吸光值时吸取的供试品溶液的体积，mL；m 为枸杞质量，g。

按照文献[26]，以芦丁为对照品，采用UV法在510 nm处测定吸光度。得到芦丁浓度（c）-吸光度（A）标准曲线，回归方程、相关系数和线性范围分别为：A=11.981C+0.0037，R2=0.9995，线性范围：0.01～0.06 mg/mL之间良好。

1.2.2 高速剪切辅助DES提取参数的单因素考察根据对四种不同方法提取枸杞黄酮的考察结果，优选出高速剪切辅助DESs提取为最佳提取方法。在此基础上，分别考察料液比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL），高速剪切转速（8000、10000、12000、14000、16000 r/min），提取时间为（1、3、5、7、9 min）对黄酮提取量的影响，料液比、转速和提取时间三个因素的固定水平分别为1:25 g/mL、12000 r/min、5 min，在对各因素进行单因素实验探究时，其他因素均取固定水平。

1.2.3 正交试验设计 以枸杞黄酮提取量为考察指标，高速剪切的转速为（A）、料液比（B）、提取时间（C）为影响因素，并通过三因素三水平L9（34）正交试验优化提取工艺，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平设计Table 1 Orthogonal test factor level design

1.2.4 不同产区生态因子与枸杞黄酮含量的相关性分析 枸杞样品于2017年9月分别采自15个具有代表性的地区（上述样品均为宁杞7号），产地生态信息来自国家气象信息中心（表2）。

表2 枸杞产地生态因子信息Table 2 Information on ecological factors of wolfberry production area

1.3 数据处理

上述实验过程每组重复三次，采用Microsoft Excel 2017、Origin9.0软件进行实验数据处理、分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 四种不同方法提取枸杞黄酮

表3可知四种提取方法中，高速剪切辅助DESs提取效果最佳，乙醇回流提取效果次之，其它2种提取方法效果较差。高速剪切辅助DESs提取法与乙醇回流提取法相比较，后者所用的溶剂体积、提取次数和提取时间远远大于前者。仅仅从黄酮提取量评价，乙醇回流提取法比高速剪切辅助乙醇提取法和超声辅助DESs提取法效率要高，但高速剪切辅助乙醇提取法和超声辅助DESs提取法所用的溶剂体积、提取次数和提取时间要远远少于前者，尚不能简单地做出结论。高速剪切辅助乙醇提取法和超声辅助DESs提取法的提取率相当，但后者所用时间要多于前者，是因为超声提取没有高速剪切强有力的破除植物细胞纤维促进活性物质流出的效果。高速剪切辅助DESs提取法和高速剪切辅助乙醇提取法相比，前者提取率显著高于后者是因为DESs中的氢键受体易于黄酮类物质的酚羟基结合，并且黄酮类化合物含有大量的酚羟基显酸性，而DESs中氯化胆碱呈碱性，结合上述两种原因，可明显增加枸杞黄酮的提取量。所以高速剪切辅助DESs结合了两者的优势，极大的增加了枸杞黄酮的提取量。因此，本研究选择高速剪切辅助DESs提取枸杞黄酮。

表3 四种提取方法提取枸杞黄酮效果的比较（n=5）Table 3 Comparison of the effect of four extraction methods on extracting flavonoids from Lycium barbarum (n=5)

2.2 单因素实验结果

图1 料液比对枸杞黄酮提取量的影响（n=3）Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the extraction volume of Lycium barbarum flavonoids （n=3）

2.2.2 转速比对枸杞黄酮提取量的影响 由图2可知，在高速剪切转速8000～12000 r/min时，黄酮提取量逐渐增大，当12000 r/min达到最大值，随着转速的增加，黄酮提取量开始略微下降后保持几乎不变。在适当的转速范围内，较大的转速可以剪碎植物细胞壁使黄酮类化合物流出，从而增大提取量，若转速大于12000 r/min后，可能导致除过黄酮以外多种杂质剪切流出，影响黄酮类化合物的释放与检测。因此选择10000、12000、14000 r/min进行后续的正交试验。

图2 转速对枸杞黄酮提取量的影响（n=3）Fig.2 Effect of rotating speed on the extraction volume of Lycium barbarum flavonoids （n=3）

2.2.3 提取时间对枸杞黄酮提取量的影响 由图3可知，在提取时间1～7 min时，黄酮提取量逐渐增加，7 min时黄酮提取量达到最大值，随着提取时间的增加，黄酮提取量几乎保持不变，可能是在7 min的时候将植物组织中的黄酮类物质全部溶出，达到最大值。因此选择5、7、9 min进行后续的正交试验。

图3 提取时间对枸杞黄酮提取量的影响（n=3）Fig.3 Effect of extraction time time on the extraction volume of Lycium barbarum flavonoids （n=3）

2.3 正交试验

2.3.1 正交试验设计及结果 以枸杞黄酮提取量为考察指标，高速剪切的转速为（A）、料液比（B）、提取时间（C）为影响因素，正交试验设计及结果见表4。

表4 正交试验结果Table 4 Results of orthogonal test

2.3.2 方差分析结果 由表4～表5可知，各因素影响程度依次为A（转速）＞C（提取时间）＞B（料液比）。其中因素 A 为 K1＜K2＜K3，因素 B 为 K1＜K3＜K2，因素C为K1＜K2＜K3；因素A的影响程度最大且有显著差异（P＜0.05），因素 B、C影响程度较小，无显著性差异（P＞0.05），综合上述条件，考虑到效率问题，最终确定最优工艺为A3B1C1，即在料液比1:20 g/mL，高速剪切的转速14000 r/min的情况下提取5 min。

表5 方差分析结果Table 5 Analysis of variance

2.3.3 验证实验 为了进一步验证上述优化工艺条件，先按照正交最佳实验条件A3B1C1，即在料液比1:20 g/mL，高速剪切的转速14000 r/min的情况下提取5 min，实验进行两组，每组平行重复3次试验，按照“1.2.1.5”项中来制备和测定出枸杞黄酮提取量。平均结果见表6。

表6 验证试验结果（n=3）Table 6 Verification test results (n=3)

实验结果表明，在上述验证实验中，进行了两组，每组平行3次，枸杞黄酮平均得率为7.11，RSD值＜5%，表明正交试验优化的提取条件稳定可行。此工艺可用来提取枸杞黄酮。

2.4 不同产区生态因子对枸杞黄酮含量的相关性分析

利用1.2.1.5的方法测得15个产地枸杞样品黄酮提取量，见表7。

表7 不同产地枸杞总黄酮提取量Table 7 Extraction volume of total flavonoids of Lycium barbarum from different producing areas

通过SIMCA 14.1软件，利用偏最小二乘回归（PLS）法分析宁夏枸杞13个产区（韩国样品a、样品b采集地不详，故不做样品分析）11个生态因子与枸杞黄酮相关性。筛选影响枸杞黄酮含量的生态因子。

用PLS法分析，生态因子与不同产地的枸杞黄酮含量的相关性由变量投影重要性指标（VIP）和正负回归系数（CoeffCS）决定，其中VIP值越大，说明生态因子对枸杞黄酮含量的影响越大，图4A中VIP值的贡献值可以看出，年积温和无霜期是枸杞黄酮形成、代谢、转化过程最主要的影响因素。CoeffCS＞0时，生态因子与枸杞黄酮含量成正相关；CoeffCS＜0时，生态因子与枸杞黄酮含量成负相关。CoeffCS的绝对值越大，相关性越大，由图4B可以看出枸杞黄酮含量与年积温和无霜期正回归系数值最大，与海拔的负回归系数绝对值最大。

图4 枸杞黄酮含量与生态因子的相关性分析Fig.4 Correlation analysis of Lycium barbarum flavonoids content and ecological factors

3 结论

本实验考察利用常规方法亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法和紫外-可见分光光度法测定枸杞总黄酮，实验结果表明在该条件下枸杞总黄酮的专属性强，测定方法简便、准确、且重复性好，可作为枸杞中总黄酮的测定方法，并且确定了以高速剪切技术辅助DESs提取枸杞黄酮为最佳的提取方法，实验通过单因素初步筛选影响因素，在此基础上采用正交试验进一步优化枸杞黄酮提取工艺，确定最佳提取工艺为料液比1:20 g/mL，转速为14000 r/min，提取5 min，此条件经验证试验表明，该提取工艺稳定、合理、可行。

本研究系统考察了主要生态因素对枸杞含量的影响，结果表明枸杞黄酮最主要的影响因素是年积温，枸杞黄酮含量与年积温和无霜期正回归系数值最大，与海拔的负回归系数绝对值最大，并且首次应用PLS法分析了生态因子对枸杞黄酮得率的综合影响，揭示了温度、海拔等因素对枸杞活性成分重要作用。对进一步研究枸杞发育过程中活性物质的代谢、合成和变化规律具有一定的借鉴意义。