酶法制备透明质酸寡糖及其透皮吸收活性研究

李慧凝，张京良，杨 艮，江晓路,,

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003；2.中国海洋大学医药学院，山东青岛 266003；3.青岛海洋生物医药研究院，山东青岛 266007；4.山东银河生物科技有限公司，山东济宁 273200）

透明质酸（Hyaluronic，HA）又称玻尿酸，是一种由N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡萄糖醛酸双糖重复单元通过β-1,3和β-1,4糖苷键构成的天然聚阴离子线性多糖[1]。HA具有独特的结构特性和生理功能，其生物活性与其分子量密切相关[2]，不同分子量HA具有不同生物活性。高分子HA具有优良的保湿性、润滑性和粘弹性等生物活性[3-4]，透明质酸寡糖（分子量＜10 kDa）具有抗氧化、促进血管生成、促进伤口愈合、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性[5-8]，在化妆品、食品、医药保健领域具有显著的应用前景。

目前，制备透明质酸寡糖的方法主要包括物理降解法、化学降解法、生物合成法和酶解法[9]，物理降解法包括超声波、机械剪切、热降解等，但此法生成的产物成分不均一，为后期产物分离纯化增加困难[10]；化学降解法包括酸解法、碱解法和氧化降解法，化学降解法需要强酸、强碱等剧烈反应条件，容易造成糖苷键断裂、基团脱落等现象，导致寡糖活性丧失[11]；生物合成法制备透明质酸寡糖需要严格的反应条件，需要多种反应酶，反应条件复杂，成本较高[12]。以透明质酸裂解酶对透明质酸进行特异性降解，克服了物理化学方法的不足，酶解法制备透明质酸寡糖由于其反应条件温和，易于控制，产物结构均一，纯度高等优点越来越成为近年的热点[13]，李憬昱[14]等通过酶解法制备了高纯度透明质酸寡糖，但目前透明质酸裂解酶产量低，价格高昂，严重限制酶法制备透明质酸寡糖的研究应用及产业化。

本课题组前期筛选获得一株高产透明质酸裂解酶的球形节杆菌，已对其发酵性能[15]和酶学性质[16]进行系统研究，研究表明该酶具有优异的发酵性能和酶学特性，具备进一步开发的潜力。本研究对该透明质酸裂解酶制备透明质酸寡糖的工艺进行研究，并对制备的透明质酸寡糖的透皮吸收等性能进行评价，以期为透明质酸寡糖的开发应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

透明质酸（HA，分子量1500 kDa） 山东众山生物科技有限公司；透明质酸裂解酶（10000 U/mL）青岛海洋生物医药研究院；其他试剂如碳酸钠、硫酸铵等均为分析纯。

L5S紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；HES-24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；Thermo Nicole Is10傅里叶变换红外光谱仪 赛默飞世尔科技公司；冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；Amazon SL离子肼电喷雾质谱 德国布鲁克道尔顿公司；SK-IV数字皮肤水分检测仪 深圳市凯尔电子厂；RYJ-6B型药物透皮扩散试验仪 上海黄海药检；AL204精密分析天平 梅特利托利多仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 底物浓度对HA酶解的影响 在加酶量2 U/mg HA的条件下，考察浓度为0.5%、1.0%、2.0%、4.0%（w/v）的HA对酶解的影响，以232 nm的紫外吸收值为指标，确定最适底物浓度。

1.2.2 加酶量对HA酶解的影响 在底物浓度1.0%（w/v）的条件下，考察加酶量为 0.1、0.2、1.0、2.0、3.0、4.0 U/mg对HA酶解的影响，以232 nm的紫外吸收值为指标，确定最适加酶量。

1.2.3 透明质酸寡糖的制备 在底物浓度1.0%（w/v）、加酶量 3.0 U/mg HA的条件下，37 ℃反应12 h，沸水浴5 min灭酶，10000 r/min离心10 min，收集上清液，冷冻干燥得透明质酸寡糖（EO-HA），备用。

1.2.4 红外光谱分析 参考Gao等[17]的方法利用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）对EO-HA进行红外扫描分析。将500 mg溴化钾烘干至恒重，加入5 mg酶解产物，以溴化钾粉末作空白对照，在4000～400 cm-1的波数范围内进行扫描。

1.2.5 质谱分析 参考Silvia等[18]的方法将EO-HA溶解于蒸馏水中，设置离子源温100 ℃，毛细管电压3000 V，样品锥孔电压40 V，在质核比（m/z）5～2000 amu范围内进行ESI-MS扫描分析。

1.2.6 吸湿性能 参考陈晓磊等[19]的方法并稍作修改测定样品的吸湿性能。以甘油为对照，在饱和硫酸铵水溶液（相对湿度RH=81%）和饱和碳酸钠水溶液（相对湿度RH=43%）环境中测定。

1.2.7 体表保湿性能 参考屈义等[20]的方法测定样品的体表保湿性能。在底物浓度1%（w/v），温度20～25 ℃，相对湿度34%～70%的条件下开展实验。随机挑选22～30岁年龄段的皮肤健康受试者10名，选取左前臂内侧相同区域5 cm×5 cm处为受试部位（受试部位在实验前2～3 d不能使用任何护肤品），清洁后，均匀涂抹样品0.1 mL，用皮肤水分测试仪测定 0、10、30、60、120 min皮肤的水分含量，在同一区域内选取不同点测定3～4次，以10%的甘油作为对照。以相对保湿率来评价样品的保湿效果，具体计算公式如下：

式中：P样t=x：使用样品一段时间后皮肤的含水率（%）；P空白：未涂样品皮肤的含水率（%）。

1.2.8 透皮吸收性能 参考唐泽严等[1]的方法测定样品的透皮吸收性能，测定采用改良的Franz扩散池，将小鼠皮肤固定在供给池与接受池之间，皮肤表层向上，供给池中加入1 mL 5 mg/mL样品溶液，接收池中加入6.5 mL 0.9%的生理盐水，设置搅拌转速 400 r/min，温度（32±0.5）℃，于 1、2、4、8、10、12 h取1 mL接受液，并补加等量的接受液。测定样品中糖醛酸含量，并以此计算单位面积累计透过量，具体计算公式如下：

式中Qn：t时间样品的单位面积累计透过量（μg/cm2）；A：透皮扩散面积（2.8 cm2）；Cn：t时间浓度测定值；Ci：t时间之前浓度测定值；V：接受池总体积（6.5 mL）；Vo：取样体积（1 mL）；J：透皮速率常数，作Qn对t的曲线得回归方程，斜率即为透皮速率常数。

1.3 数据处理

试验重复3次，结果用平均值±标准差来表示；采用软件SPSS 19.0和GraphPad Prism 8.0对数据进行数据统计及显著性分析；采用Origin 9.0进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 底物浓度对HA酶解的影响

透明质酸裂解酶通过β消除机制作用于β-1,4糖苷键，在葡萄糖醛酸残基C4，C5间形成不饱和双键，在232 nm处有特征吸收，可以通过232 nm的紫外吸收变化监控酶解反应进程[21]。底物浓度对酶解度的影响如图1所示，在底物浓度为0.5%～4%范围内，随着底物浓度的增加，A232 nm先显著增加（P＜0.05），当底物浓度为1%时，A232 nm达到最大，降解效果较好，后有所降低（P＜0.05）。这可能是由于随HA浓度增加，黏度逐渐升高，限制了透明质酸酶与HA的结合，从而影响酶解效率。因此，选择最适底物浓度为1%（w/v）。

图1 底物浓度对HA酶解的影响Fig.1 Effect of substrate concentration on HA enzymatic hydrolysis

2.2 加酶量对HA酶解的影响

加酶量是影响酶解反应的重要因素之一，适宜的加酶量有利于更快获得目标产物，提高生产效率。加酶量对HA酶解的影响如图2所示，在底物浓度为1%（w/v）条件下，随着加酶量的增加，A232 nm呈先显著增加（P＜0.05）后无显著变化（P＞0.05）的趋势。当加酶量增加到3 U/mg时，A232 nm快速增加，但当加酶量继续增加到4 U/mg时，A232nm值增加趋势变缓，表明酶与底物结合趋于饱和。综合考虑成本、酶解效率等，选择3 U/mg为最适加酶量。

图2 加酶量对HA酶解的影响Fig.2 Effect of enzyme dosage on HA enzymatic hydrolysis

2.3 红外光谱分析

通过红外光谱对样品进行分析结果如图3所示，HA和EO-HA都具有糖类特征吸收峰，在3600～3200 cm-1出现O-H键的伸缩振动，在3420.78 cm-1处有宽吸收峰，表明其具有氢键[22]。2899.10 cm-1处的吸收峰是由于C-H键的伸缩振动，1616.68 cm-1处的吸收峰是由于乙酰氨基中C=O的伸缩振动，1411.24 cm-1处的吸收峰是由于C-O的伸缩振动，1377.70 cm-1处的吸收峰是由于C=O的对称伸缩振动[23]，1206.41 cm-1和1042.64 cm-1处的吸收峰是由于O-H键的弯曲振动造成，在1150.99 cm-1处的吸收峰是由于C-O-C键的存在[24]。此外，在894.06 cm-1处的吸收是由于吡喃糖中C-H键的弯曲振动引起的[25]。此结果表明，HA和EO-HA的红外分析基本一致，表明EO-HA在温和条件下被透明质酸裂解酶特异性地解聚，没有基团脱落，在一定程度上，保留了结构的完整性。

图3 HA和EO-HA的FT-IR图谱Fig.3 FT-IR spectrum of HA and EO-HA

2.4 质谱分析

EO-HA质谱结果如图4所示，结果表明质谱图中峰主要集中在378.1（[M-H]-），由于透明质酸裂解酶酶解位点为β-1,4糖苷键，酶解位点专一，其酶解产物结构主要是不饱和HA二糖（△DiHA）。757.2（[M-H]-）和 779.2（[M-2H+Na]-）为单电荷峰及双电荷峰，其结构为不饱和HA四糖（o-HA4）。175.0（[M-H]-）为碎片峰，其结构为不饱和糖醛酸（△UA）。透明质酸酶在降解HA的过程中首先进行随机内切，将HA降解为低分子量片段，然后再从头裂解HA持续产生以△DiHA为主要降解产物的透明质酸寡糖[26]。此透明质酸裂解酶的作用模式与S.zooepidemicus的作用模式较为类似[27]。

图4 EO-HA的质谱分析Fig.4 Negative-ion electrospray mass spectra of EO-HA

2.5 吸湿性能

HA、EO-HA及甘油的吸湿性能如图5所示，由图5可知，在饱和硫酸铵和饱和碳酸钠环境下，三者吸湿率均在0～12 h迅速增加，在12 h之后增加缓慢，HA在初始阶段吸湿性能优于EO-HA，但后期两者的吸湿性能基本一致。此结果表明HA及EOHA均具有良好的吸湿性能。

图5 HA和EO-HA的吸湿性能分析Fig.5 Moisture abilities of HA and EO-HA

2.6 体表保湿性能

皮肤水分测试仪可根据角质层含水量的高低所引起电阻的变化，从而反应出皮肤角质层含水率的变化，这种方法是目前保湿护肤品保湿功效评价常用的方法之一，皮肤角质层含水率可以用来反映HA和EO-HA的保湿效果，角质层水分含量越高，其保湿性能越好[28]。HA、EO-HA及甘油体表保湿性能如表1所示，初始阶段，EO-HA保湿性能较HA弱，且极显著低于甘油保湿性能（P＜0.01），但随时间延长至2 h时，EO-HA的保湿效果显著优于HA保湿效果（P＜0.05）。这可能是由于在初始阶段HA较EO-HA黏度大，易成膜，锁水性能好。但后期阶段，EO-HA分子量小，可以顺利通过40～50 nm的细胞间隙进入角质层，进行深度保湿，HA则无法通过[29]。因此，EO-HA的保湿效果较HA更优异。而甘油作为传统的保湿剂，在体表保湿效果上，表现出理想的保湿性能。

表1 HA和EO-HA及甘油的体表保湿效果Table 1 Moisture retention of HA, EO-HA and glycerin on the skin

2.7 透皮吸收性能

HA及EO-HA的透皮吸收曲线均趋于直线，作Qn对t的方程得到各样品的透皮动力学方程，结果如表2所示：HA及EO-HA的累计透过量如表3所示。由表2中各样品的动力学方程可以看出，HA及EO-HA的单位面积累计透过量随着时间的变化呈线性增长，符合零级动力学方程。透皮吸收系数J反应透皮吸收率，酶法制备的EO-HA的透皮吸收系数最大，表现了较好的透皮吸收性，透皮吸收性能优异，由表3可知，在24 h，EO-HA的累计透过量为1.113 μg/cm2，而未降解的HA的累积透过量最低，仅为0.075 μg/cm2，表明分子量越低，其透皮吸收效果越好。而透皮吸收性能越好，体表保湿性能越优异，两者结果一致。这可能是由于高分子HA流动性差，难以透过角质层，而经透明质酸裂解酶降解产生的EO-HA，分子量小，黏度小，可以更好地进入角质层，达到深度保湿的效果。同时，EO-HA可以增加皮肤内源性透明质酸含量，刺激胶原蛋白的生成[30]，延缓人体衰老。

表2 HA和EO-HA的透皮动力学参数Table 2 Penetration kinetic parameter of HA and EO-HA

表3 HA和EO-HA的累计透过量Table 3 Cumulative penetration amount of HA and EO-HA

3 结论

近年来，研究发现透明质酸及其寡糖具有多种生物功能，成为研究热点。本实验采用透明质酸裂解酶酶解制备透明质酸寡糖，对底物浓度及加酶量进行优化，并利用傅里叶红外变换光谱和质谱进行寡糖结构分析结果表明反应透明质酸裂解酶降解透明质酸的最适底物浓度为1%，最适加酶量为3.0 U/mg，红外光谱表明酶解过程基本没有基团脱落，保留了透明质酸的结构完整性，酶解产物EO-HA以不饱和透明质酸二糖为主，含有少量的不饱和糖醛酸和和不饱和透明质酸四糖。对EO-HA与HA的吸湿性能、体表保湿性能与透皮吸收性能进行研究，结果表明EOHA吸湿性能与HA基本一致，EO-HA在120 min时皮肤的含水率较HA提高10%左右，显示出良好的体表保湿性能，EO-HA 24 h的累计皮肤透过量为1.133 μg/cm2，显著（P＜0.05）高于 HA，表明 EO-HA具有优异的透皮吸收性能。上述研究表明，EO-HA具有优良的体表保湿与透皮吸收性能，可以发挥深度保湿，补充内源性HA，刺激胶原蛋白生产等生理功能，可以广泛应用于化妆品、外用制剂等产品开发，在生物化工领域具有广阔的应用前景。