内质网应激通路在棕榈酸诱导的人牙周膜干细胞凋亡中的作用

刘 涛 李 晶 鲍翠玉

1.湖北科技学院附属第二医院口腔科，湖北咸宁 437100；2.湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北咸宁 437100

牙周病是一种由多种因素引起成年人牙齿脱落的炎症性疾病[1]。据报道[2-3]，糖尿病促进了牙周病的发生和严重的牙槽骨丢失[4]，血糖、血脂过高导致牙周附着丧失[5]，而且脂毒性对机体的危害远远高于糖毒性[6]。人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）是牙周组织中一种自我更新多向分化的间充质干细胞[7-8]，已证实其凋亡是牙周器质性病变的重要因素[9]。近年研究发现牙周病的防治与内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）途径的激活有关[10]。棕榈酸（palmitic acid，PA）通过ERS 诱导细胞凋亡引发多种疾病[11]，也可诱导hPDLSCs 凋亡和抑制其成骨分化[12]，但是ERS 对PA 诱导的hPDLSCs 凋亡的作用机制目前尚未明确。本研究通过观察PA 对hPDLSCs的存活率、细胞凋亡荧光变化、ERS 凋亡相关蛋白的表达，探讨PA 是否通过ERS 凋亡通路促进hPDLSCs凋亡。以期为糖尿病性牙周病的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株

hPDLSCs（上海莼试生物技术公司）。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM 培养基（Hyclone，SH30021.01）；胎牛血清（Gibco，26140-079）；PA（Sigma，P5585）；4-PBA（Sigma，P21005-25G）；Annexin VFITC-PI 试剂盒（贝博，BB4101-50T）；MTT 粉末（众一生物科技，M1124）、BCA 试剂盒（碧云天，P0012S）；抗ATF4（1181S）、PERKphos（3179S）、IRE1phos（3294S）、ATF6（11587-1-AP）、Cleaved caspase-3（9661S）均购于CST，CHOP（Proteintech，15204-1-AP），β-actin（Abclonal，AC026）；CO2细胞培养箱（BBD6220）；倒置荧光显微镜（CKX41）；多功能酶标仪（Synergy 2）；自动发光凝胶成像系统（Biosens SC920）；垂直式电泳仪（1645050）。

1.3 实验分组

本课题组前期预试验发现PA 抑制hPDLSCs 细胞增殖呈时间和浓度依赖性，基于本课题组前期研究[13]，本实验PA 刺激时间选择24 h。①为探究PA 抑制hPDLSCs 增殖的作用机制，将细胞随机分为对照组（不含PA 的培养基）和PA 低、中、高浓度（0.1、0.2、0.4 mmol/L）组。②为探究4-PBA 对PA 所致hPDLSCs凋亡的影响，将细胞分为随机对照组（不含PA 的培养基）、PA（0.4 mmol/L）组、PA（0.4 mmol/L）+4-PBA（5 μmol/L）组。

1.4 MTT 法检测hPDLSCs 增殖率

在96 孔板中接种hPDLSCs 心肌细胞，在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞贴壁24 h 后，将细胞按照“①”进行分组，每组设置6 个复孔，对照组加入不含PA 的培养基，PA 各浓度组分别加入0.1、0.2、0.4 mmol/L 的PA 处理细胞24 h。实验结束后弃去孔内上清液，加入20 μl/孔浓度为5 g/L MTT 溶液，避光孵育4 h 后弃液，加入150 μl DMSO，摇震10 min，570 nm 处测量各孔光密度值，细胞增殖率按前期本课题组计算方法计算[13]。

1.5 Annexin V FITC-PI 观察hPDLSCs 凋亡情况

按500 μl/孔将hPDLSCs 接种在24 孔板内，孵育过夜，将细胞按照“①”进行分组，对照组加入不含PA的培养基，PA 各浓度组分别加入0.1、0.2、0.4 mmol/L的PA 处理细胞24 h。每组设置3 个复孔，继续孵育24 h，按照试剂盒操作说明，洗涤细胞3 次，4%多聚甲醛固定10 min，再洗涤3 次。依次加入Annexin V-FITC结合液、Annexin V-FITC 和PI，轻轻混匀，室温避光孵育10 min。封片，荧光拍照并分析保存图像。

1.6 Western blot 法检测蛋白表达

探究PA 抑制hPDLSCs 增殖的作用机制时，将细胞按照“①”进行分组，对照组加入不含PA 的培养基，PA 各浓度组分别加入0.1、0.2、0.4 mmol/L 的PA 处理细胞24 h。洗净各组细胞，加入RAPI 裂解液，收集细胞，冰上裂解15 min，提取上清液蛋白样本，用BCA试剂盒测定蛋白。上样量为20 μg、SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白、转膜、1×TBST 洗膜、脱脂牛奶封闭膜2 h，一抗（1∶1000）4℃摇床孵育过夜，二抗（1∶5000）室温摇床孵育1 h，洗涤后用ECL 显影液处理，经凝胶成像仪分析成像，计算ATF4、CHOP、PERKphos、IRE1phos、ATF6、Cleaved caspase-3 与内参灰度值比值，每组实验重复3 次。探究4-PBA 对PA 所致hPDLSCs 凋亡的影响，将细胞按照“②”进行分组，对照组加入不含PA 的培养基，PA 组加入0.4 mmol/L 的PA 处理细胞24 h，PA+4-PBA 组加入0.4 mmol/L 的PA 和5 μmol/L的4-PBA 处理细胞24 h。实验方法同上，计算CHOP、PERKphos、Cleaved caspase-3 与内参灰度值比值，每组实验重复3 次。

1.7 统计学方法

使用GraphPad Prism 5 对结果作图并进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素ANOVA 分析，两两比较采用LSD-t 分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PA 对hPDLSCs 增殖率的影响

与正常组比较，PA 低、中、高浓度组均明显抑制hPDLSCs 增殖，差异有统计学意义（P ＜0.05），其中PA 高浓度组细胞存活率已降到50%以下。见图1。

2.2 PA 对hPDLSCs 凋亡的影响

对照组FITC 标记的绿色荧光和PI 标记的红色荧光均较弱，而在PA 低浓度组开始出现绿色荧光，PA 中浓度组明显增强并发现红色荧光，PA 高浓度组两种荧光明显增强，细胞数目明显减少，细胞凋亡相关形态学改变。见图2。

2.3 PA 对hPDLSCs 内质网应激信号通路激活的影响

PA 高浓度组IRE1phos、PERKphos、ATF6、ATF4、CHOP蛋白表达较正常组明显上调，中、高浓度组Cleaved caspase-3 蛋白表达较正常组均明显上调，差异有统计学意义（P ＜0.05），而低、中浓度组IRE1phos、PERKphos、ATF6、ATF4、CHOP 蛋白和低浓度组Cleaved caspase-3蛋白的表达与对照组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），与PA 低、中浓度组比较，PA 高浓度组IRE1phos、PERKphos、ATF6、ATF4、CHOP、Cleaved caspase-3 蛋白表达均明显升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3。

2.4 4-PBA 对PA 诱导的hPDLSCs 凋亡相关蛋白表达的影响

PA 组PERKphos、CHOP、Cleaved caspase-3 蛋白表达较对照组明显升高（P ＜0.05），而ERS 抑制剂4-PBA 预处理后，PA+4-PBA 组PERKphos、CHOP、Cleaved caspase-3 较PA 组蛋白表达下调，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图4。

3 讨论

随着对糖尿病牙周病的深入研究发现，血液中游离脂肪酸代谢紊乱是糖尿病患者常伴有的症状，主要表现为高脂血症[5]。有研究报道游离脂肪酸通过抑制TIMP-1 表达来促进人牙周膜成纤维细胞凋亡[14]，高浓度的脂肪酸引起牙周微血管功能障碍，牙槽骨丧失，hPDLSCs 凋亡及相关凋亡基因表达上调[15]，动物实验也证实高脂饮食的糖尿病大鼠牙槽骨丢失[16]。因此，评估高脂对牙周组织的不良作用机制很重要，本实验选择PA 作为脂毒性刺激因素，发现hPDLSCs 的增殖率与PA 刺激的浓度有关，PA 高浓度组中凋亡荧光显著增强，显示PA 能诱导hPDLSCs 凋亡，提示造模成功。

近年来发现脂肪酸可以通过多种机制诱导细胞凋亡，尤其ERS 通路因与炎症牙周膜细胞凋亡密切相关而备受关注[17]。内质网是细胞的重要细胞器，在蛋白质合成、折叠和成熟过程中起着重要作用。Ca2+稳态紊乱和内质网腔内未折叠或错误折叠蛋白的积累时，导致ERS。在正常情况下，ERS 通过增加蛋白质折叠能力，激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）来恢复内质网稳态。PERK、ATF6、IRE1 是三种内质网定位的跨膜蛋白，其作为内质网腔内错误折叠蛋白的传感器，被GRP78 覆盖。但在错误折叠蛋白的存在下，这些伴侣被分离，相应的UPR 信号通路被激活，从而通过ERS 特异促凋亡因子即CCAAT/CHOP促进细胞凋亡[18-20]。在本研究中，高浓度组ERS 相关蛋 白IRE1phos、PERKphos、ATF-6、ATF-4、CHOP 表达增加，此结果显示高浓度的PA 可以激活ERS 信号通路，引起相关蛋白表达增加。

caspase 家族在细胞凋亡中起关键作用，其与多种蛋白因子共同调控细胞凋亡[21]。激活的PERK、IRE1和ATF6 通过上调下游分子CHOP 来增强caspase-3的转录活性。高表达的caspase-3 可介导细胞凋亡的级联反应，促进细胞凋亡[22-23]。此外，内质网中Ca2+稳态的破坏可以引发ERS，导致Cyt-C 等凋亡因子从线粒体膜内释放，从而激活caspase 凋亡信号通路[24]。本研究结果提示高浓度的PA 可以诱导hPDLSCs 凋亡。4-PBA 是一种众所周知的ERS 抑制剂，在ERS 引起的多种疾病中有着重要治疗潜力[25]。本研究显示，PA+4-PBA 组与PA 组比较，PERKphos、CHOP、Cleaved caspase-3的表达明显降低，提示4-PBA 可以抑制高浓度的PA激活的ERS 信号通路，逆转hPDLSCs 凋亡，此结果进一步提示高浓度的PA 造成hPDLSCs 凋亡可能通ERS凋亡途径。

综上所述，高脂能够抑制hPDLSCs 增殖，并促进其凋亡，其作用机制可能与ERS 凋亡途径的活化有关。因此，ERS 通路在糖尿病牙周病的发病过程中具有重要作用，这为理解糖尿病牙周病的形成机制提供新的线索，也可能为临床预防和治疗糖尿病牙周病提供新策略。