高糖环境下糖络宁对大鼠背根神经节神经元细胞凋亡水平及MAPKs 信号通路的影响

朱雨菲 郭宇鑫 王利莹 李 矜 张涛静

1.北京中医药大学第二临床医学院，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院内分泌科，北京 100078

国际糖尿病联合会统计2019 年中国20～79 岁糖尿病患病人数约1.16 亿，位居世界榜首[1]。病程进展中60%～70%的患者会患上神经病变，以糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）最多见[2]，DPN 以肢体末端麻木疼痛、腱反射减弱消失为主要症状[3]，给患者健康及生活造成负担[4]。DPN 是多因素共同作用的结果，晚期糖基化终产物途径、氧化应激、炎症作用、RNA 非编码调节等因素均发挥了直接或间接的作用[5-7]。高糖环境提高背根神经节神经元（dorsal root ganglion neuron，DRGn）细胞凋亡水平是导致DPN 及其进展的重要机制[8-9]。本研究旨在观察糖络宁对高糖下DRGn 细胞凋亡水平及丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信号通路的调节作用，以探索糖络宁治疗DPN 的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物及环境

临产期SPF 级和60 只（215±15）g 清洁级6～8 周SD 雄性大鼠，动物许可证号：SCXK（京）20160006，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于大鼠SPF 级屏障环境中[动物使用许可证号：SYXK（京）2019-0013]，温度（20±2）℃，湿度45%～65%，12 h 明暗交替。实验流程由北京中医药大学第二临床医学院伦理委员会论证通过（编号：BUCM201738）。

1.2 主要药物及试剂

由北京中医药大学东方医院制剂室提供约为生药0.5 g/ml 糖络宁制剂（黄芪15 g、生地黄12 g、当归15 g、狗脊15 g、牛膝12 g、木瓜15 g、丹参15 g、川续断10 g）。兔抗p-JNK1（货号：ab110724）、JNK1（货号：ab47337）、p-c-Jun（货号：ab32137）、c-Jun（货号：ab30620）、p-Map3k8（货号：ab217684）、Map3k8（货号：ab51214）购自Abcam 公司。葡萄糖（货号：15023021），Neurobasal 培养基（货号：21103049）购自Gibco。Annexin V-FITC/PI Kit/凋亡检测试剂盒（货号：FXP018）购自北京四正柏生物科技有限公司。BCA 蛋白定量试剂盒（货号：MD913053）购自MDL。

1.3 主要仪器

倒置显微镜（DS126281）购自日本Canon 公司，电泳仪（BG-subMIDI）购自北京百晶生物技术有限公司，低温离心机（3-30K）购自德国Sigma 公司，体视显微镜（XTL-165）购自江西凤凰光学科技有限公司，凝胶成像系统（GelDoc-It310）购自美国UVP 公司。

1.4 研究方法

1.4.1 制备含药血清 制备含药血清参照前期研究[10-11]。60 只大鼠适应性喂养7 d 后，采用随机数字表法分为正常组和高、中、低浓度糖络宁组，每组15 只。糖络宁组分别予组方生药5、2.5、1.25 g/（kg·d）灌胃，正常组予等量蒸馏水灌胃，2 次/d，连续10 d，期间自由饮食。末次灌胃后2 h 内自大鼠腹主动脉取血，以3000 r/min离心10 min（离心半径95 mm），分离血清，56℃水浴灭活30 min，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，-80℃存用。

1.4.2 DRGn 细胞取材、培养 细胞取材培养参照既往研究[12-13]及前期实验[10-11]。将培养好的细胞随机分为正常组，高糖组，低、中、高浓度糖络宁组。正常组用含10%正常大鼠血清和Neurobasal 培养基（含25%葡萄糖），高糖组按前期结果[11]在正常组基础上加50 mmol/L葡萄糖，糖络宁组在高糖组基础上加10%低、中、高浓度糖络宁含药血清。各组均设置3 个复孔。分别培养24 h。

1.4.3 流式法检测DRG 细胞凋亡水平 将培养24 h 的细胞消化收集，制备细胞悬液（1×105/ml～5×105/ml）。按Annexin V-FITC/PI Kit/凋亡检测试剂盒说明书操作，室温避光将5 μl Annexin V/FITC 和100 μl 细胞悬液混匀，孵育5 min 后加入400 μl PBS 和10 μl PI，1 h内检测凋亡情况。采用CellQuest 软件绘制双色散点图。实验重复3 次。

1.4.4 Western blot 法检测DRG 中MAPKs 通路相关蛋白表达水平 冰浴条件下裂解细胞，提取总蛋白。制备SDS-PAGE 电泳，据BCA 蛋白定量结果，将样品加入SDS-PAGE 凝胶加样孔中，电泳，转膜，室温下于5%脱脂奶粉中摇床上封闭1 h，分别孵育一抗p-JNK1（1∶1000）、JNK1（1∶1000）、p-c-Jun（1∶500）、c-Jun（1∶1000）、p-Map3k8（1∶1000）、Map3k8（1∶100），4℃过夜，TBST 洗涤10 min，重复3 次，同样条件下孵育二抗（1∶4000）1 h，TBST 洗膜，电化学发光增强剂显色、成像。Image-Pro Plus6.0 软件分析所得蛋白条带灰度值。实验重复3 次。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组DRGn 细胞凋亡率比较

高糖组细胞凋亡率显著高于正常组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；糖络宁各组细胞凋亡率明显低于高糖组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01），中浓度糖络宁组细胞凋亡率低于高、低浓度糖络宁组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表1、图1。

表1 各组细胞凋亡率比较（%，，n=3）

表1 各组细胞凋亡率比较（%，，n=3）

注 与正常组比较，aaP ＜0.01；与高糖组比较，bbP ＜0.01；与低浓度糖络宁组比较，ccP ＜0.01；与高浓度糖络宁组比较，ddP ＜0.01

2.2 各组MAPKs 通路相关蛋白表达比较

高糖组p-JNK1、p-c-Jun、Map3k8、p-Map3k8 表达及p-JNK1/JNK1、p-c-Jun/c-Jun、p-Map3k8/Map3k8比值明显高于正常组，差异有统计学意义（P ＜0.05或P ＜0.01），高糖组与正常组JNK1、c-Jun 表达，差异无统计学意义（P ＞0.05）；糖络宁各浓度组p-JNK1、p-c-Jun、p-Map3k8 表达及p-JNK1/JNK1、p-c-Jun/c-Jun、p-Map3k8/Map3k8 比值明显低于高糖组，差异有统计学意义（P ＜0.01 或P ＜0.05）；中浓度糖络宁组p-JNK1、p-c-Jun、p-Map3k8 表达及p-JNK1/JNK1、p-c-Jun/c-Jun、p-Map3k8/Map3k8 比 值明显低于高、低浓度糖络宁组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；中、低浓度糖络宁组c-Jun 表达低于高糖组，差异有统计学意义（P ＜0.05），糖络宁各浓度组JNK1、Map3k8 及c-Jun 表达比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表2 各组MAPKs 通路相关蛋白表达比较（，n=3）

表2 各组MAPKs 通路相关蛋白表达比较（，n=3）

注 与正常组比较，aP ＜0.05，aaP ＜0.01；与高糖组比较，bP ＜0.05，bbP ＜0.01；与低浓度糖络宁组比较，ccP ＜0.01；与高浓度糖络宁组比较，ddP ＜0.01

3 讨论

临床研究[14-15]证实糖络宁疗效显著，但其机制仍有待研究。既往实验发现，糖络宁通过促进PI3K/AKT信号通路，抑制PERK 通路[16]，抑制内质网应激中IRE1α等蛋白表达[17]，降低Bax/Bcl-2 比值[18]等，抑制细胞凋亡。

研究表明MAPKs 信号通路的激活与神经细胞凋亡有密切联系[19-20]。MAPKs 通路主要包括ERK1/2、JNK、p38MAPK[21-23]，可通过连续酶促反应，将胞外信号通过磷酸化传至胞内，参与增殖、分化、凋亡等过程。JNK1、Map3k8 为该通路中参与调控细胞凋亡的关键性激酶。Map3k8 磷酸化后激活MAPK 激酶1/2[24]，进而激活并磷酸化ERK1/2。实验[25-27]显示高糖环境可激活JNK、ERK1/2 途径，诱导细胞凋亡。c-Jun 为核内转录因子，能被JNK1 磷酸化，调节下游凋亡靶基因转录，诱导FasL、TNF 等死亡配体表达，与死亡受体Fas、TNFR 合成死亡诱导信号复合物，最终使caspase酶活化，通过死亡受体途径介导细胞凋亡[28]。

本研究结果显示，高糖刺激可提高DRGn 细胞凋亡水平和p-JNK1、p-c-Jun、p-Map3k8 蛋白表达，提示高糖可使MAPKs 通路激活，上调细胞凋亡水平。经糖络宁含药血清作用后，糖络宁各浓度组细胞凋亡水平及p-JNK1、p-c-Jun、p-Map3k8 蛋白表达明显低于高糖组，糖络宁含药血清对细胞凋亡及MAPKs 通路的作用与高糖刺激下相反，即糖络宁对该通路有抑制作用，同时可抑制DRGn 细胞凋亡。MAPKs 通路在细胞凋亡中发挥着重要作用，结合本研究结果显示高糖刺激可激活该通路诱导细胞凋亡，而糖络宁可通过抑制MAPKs 信号通路来降低DRGn 细胞凋亡水平，从而延缓DPN 进展。这可能是糖络宁治疗DPN的机制之一，但其具体作用成分尚未明确，仍有待研究。