DNA甲基化通过调控细胞自噬影响家蚕翅的发育

龚程程, 吕 浩, 郑思春, 徐关峰

(华南师范大学生命科学学院, 广东省昆虫发育生物与应用技术重点实验室, 广州 510631)

DNA甲基化修饰广泛存在于真核生物中，是表观遗传学重要的调控形式之一，以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，将甲基基团转移到胞嘧啶(C)上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)(Adams, 1996)。自Sarkar等于1992年发现昆虫基因组中存在DNA甲基化修饰以来，越来越多的研究表明DNA甲基化普遍存在于昆虫中(Sarkaretal., 1992; Huntetal., 2013)。昆虫基因组DNA甲基化水平要远远低于哺乳动物的(约60%～90%)，大多数昆虫的DNA甲基化水平都小于1%(Bewicketal., 2017)。DNA甲基化在昆虫发育中的功能主要涉及昆虫繁殖、级型分化、基因组印迹、翅发育、性状分化和抗药性等(Goll and Bester, 2005; Wangetal., 2013; Xiangetal., 2013; 梁士可等, 2014; Bewicketal., 2019)。然而，昆虫DNA甲基化作用机制尚需深入的研究。

细胞自噬(autophagy)，作为细胞程序性死亡的一种主要形式，其主要功能是去除衰老/受损细胞，以及降解细胞内多余物来维持细胞稳态。在动植物中，细胞自噬的发生往往起始于细胞自噬相关蛋白(autophagy related protein, Atg)所参与形成的细胞自噬小体(Griffin, 2005; Orvedahletal., 2010)。细胞自噬小体的形成经历一个复杂的过程，包括起始、成核、延伸和成熟等。起始和成核主要由两种蛋白复合体ATG1-ATG13和BECN1/ATG6-PI3K3C来完成。延伸和成熟主要由两个泛素样蛋白系统ATG12-ATG15和LC3-ATG8-PE来完成(Yang and Klionsky, 2010; Boyaetal., 2013)。Light Chain 3(LC3)蛋白是一种公认的细胞自噬标记物，主要存在形式为LC3-I，在细胞自噬发生过程中，细胞质内LC3-I蛋白转移到自噬小体内，经泛素化修饰后形成LC3-II，并定位于成熟的自噬小体的膜上，因此可以通过荧光标记的LC3-II来识别自噬小体(Tanidaetal., 2004)。

我们的前期工作通过利用DNA甲基化抑制剂5-氮-2′脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-aza-dC)处理家蚕Bombyxmori，证明了DNA甲基化修饰通过抑制几丁质酶的表达，从而保证了翅几丁质含量和翅的正常发育(Xuetal., 2020)，表明DNA甲基化修饰在翅的发育中起着重要的调控作用。然而，通过转录组分析，我们发现DNA甲基化可能是通过多种途径来调控翅的发育。为此，本研究将进一步探讨DNA甲基化修饰是否通过抑制细胞自噬以保证翅发育的可能性。5-aza-dC作为一种DNA甲基化的特异性抑制剂，已被证明可以有效降低生物体内的DNA甲基化水平(Dastjerdietal., 2014; Cooketal., 2019)。本研究中对家蚕预蛹和卵巢Bm12细胞分别进行5-aza-dC和细胞自噬激活剂SMER28的处理以及细胞自噬抑制剂Spautin-1的挽救注射，观察与测定家蚕Bm12细胞和翅细胞的自噬水平以及成虫翅的表型，从而分析DNA甲基化对细胞自噬和家蚕翅发育的调控作用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本实验所用的家蚕品种为大造，蚕卵由广东省蚕业研究所提供。幼虫在温度26.5±0.5℃、相对湿度70%和光周期14L∶10D的人工气候箱中饲养。新鲜桑叶采摘自华南农业大学蚕学桑园实习基地。

家蚕卵巢Bm12细胞株来自华南农业大学动物科学学院。细胞置于含10%胎牛血清的昆虫培养液的培养瓶，于27～28℃恒温培养箱中培养。每隔3～4 d按1∶3的比例传代培养。

1.2 5-aza-dC处理家蚕细胞

为了证明DNA甲基化抑制剂5-aza-dC能够有效抑制家蚕细胞内的DNA甲基化水平，我们用5-aza-dC处理家蚕卵巢Bm12细胞。将1 mg 5-aza-dC(Sigma, California, 美国)溶于ddH2O中，配制成浓度为10 μg/μL的母液。将现配制的母液稀释10倍至终浓度为1 μg/μL。家蚕卵巢Bm12细胞以合适的密度在12孔板上铺板，待细胞密度长至80%左右，将1 μg 5-aza-dC加入到12孔板的每孔家蚕卵巢Bm12细胞中。

按照DNA抽提说明书分别提取上述5-aza-dC处理12, 24和48 h的Bm12细胞的总DNA，并用RNase A(Promega, Madison, 美国)消化残留的RNA杂质，基因组DNA样品稀释至100 ng/μL，1.5 μg基因组DNA在95℃ 5 min变性后，将DNA样品点在硝酸纤维素印迹膜上，于加热器上干燥。膜干燥后进行UV交联2 min。随后用3% TBST室温封闭2 h。封闭完成后，于室温下与一抗(5mC抗体，1∶1 000稀释)孵育3 h(或4℃过夜孵育)。接着将膜与碱性磷酸酶标记的山羊抗兔二抗IgG抗体(1∶4 000稀释)在37℃孵育60 min。用四唑淡蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(NBT/BCIP)显色液进行显色反应。显色结束后，将膜置于终止液中清洗以终止显色，拍照成像，进行dot blot检测。

将5-aza-dC处理12, 24和48 h后的Bm12细胞通过EVOS FL Auto荧光显微镜(Thermo Fisher, Waltham, 美国)进行观察和成像，随后通过ImageJ软件计算每8 000 μm2的Bm12细胞数量，进行细胞数量的统计，探究DNA甲基化对家蚕细胞生长的影响。

1.3 LC3蛋白的过表达和Western blot检测

LC3可用来指示细胞自噬程度(Tanidaetal., 2004)。为了进一步验证DNA甲基化调控家蚕细胞自噬的强度，我们构建3×FLAG-LC3过表达载体。提取Bm12细胞总RNA，反转录为cDNA作为扩增LC3基因的模板。利用Primer Premier 5.0设计引物(表1)扩增家蚕LC3基因的ORF区域，通过上游引物在LC3蛋白氨基端引入3×FLAG标签，进行PCR，反应体系: 2×Hieff PCR Master Mix(Yesen, 广州) 10 μL, cDNA模板2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, 无核酸酶水6.4 μL。PCR反应程序: 95℃ 3 min; 95℃ 30 s, 50℃ 30 s, 72℃ 60 s, 32个循环; 4℃保持。利用DNA凝胶回收试剂盒(Magen, 广州)进行PCR产物回收。回收的DNA片段连接到pMD-18T(TaKaRa, 大连)载体上。随后利用KpnⅠ和BamHⅠ酶将目的片段从pMD-18T载体上切下来连入pEGFP载体，构建3×FLAG-LC3-EGFP载体。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

将构建好的2 μg 3×FLAG-LC3-EGFP超表达载体和6 μL Fugene HD(Promega, Madison, 美国)加于EP管中，用Opti-MEM(Life Technologies, Grand Island, 美国)无血清培养基补足到50 μL，充分混合。将配好的混合液室温静置15 min，加入到家蚕卵巢Bm12细胞培养液12孔板中进行细胞转染，并在实验组细胞中加入1 μg 5-aza-dC处理。24和48 h后分别收集Bm12细胞的总蛋白。蛋白变性后在12% SDS-PAGE凝胶中分离，随后转移至硝酸纤维素印迹膜(GE Healthcare)。将膜置于含有3% (w/v) BSA的TBST中37℃封闭2 h或4℃封闭过夜。封闭结束后，用TBST洗膜3次，加入1% TBST稀释1∶2 000的FLAG一抗(#14793, Cell Signaling Technology, MA, 美国)，37℃孵育3 h或4℃过夜。一抗孵育结束后，用TBST洗膜3次，加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG二抗(IA-0071, Dingguo, 北京)，室温孵育1～2 h。室温下用TBST洗膜2次和TBS洗膜1次，最终用NBT/BCIP显色液进行显色反应。显色结束后，将膜置于终止液中清洗以终止显色，最后将显色好的膜取出，拍照。

1.4 免疫组化

将家蚕卵巢Bm12细胞以合适的密度接种到12孔细胞板的爬片上， 待细胞密度长至80%左右进行质粒转染。将2 μg 3×FLAG-LC3-EGFP超表达载体和6 μL Fugene HD(Promega, Madison, 美国)加于EP管中，用Opti-MEM(Life Technologies, Grand Island,美国)无血清培养基补足到50 μL，充分混合进行转染。同时加入1 μg 5-aza-dC处理细胞，转染48 h后用4%多聚甲醛固定细胞10～20 min，随后用含0.5% Triton的PBT处理，于室温通透30 min。用含有2% BSA和5%山羊血清的封闭液，于室温封闭2 h。封闭完成后，于室温下以1∶200稀释的FLAG一抗(#14793, Cell Signaling Technology, MA, 美国)孵育3 h(或4℃过夜孵育)。再以1∶200 Alexa-594标记的二抗(Invitrogen, 美国)孵育2 h。每两个步骤之间用0.1% PBT洗3次。二抗孵育且PBT洗后，用Prolong Gold/DAPI (Invitrogen, 美国)染色封片后，使用FV3000共聚焦显微镜(Olympus, 日本)进行观察FLAG-LC3I/II的分型情况。

1.5 DNA甲基化对细胞自噬和家蚕翅发育的影响

为了探究DNA甲基化是否影响细胞自噬和家蚕翅的发育，选取50～60头预蛹期的家蚕，在冰上放置30 min，从腹部第2胸节注射2 μg 5-aza-dC，对照组注射相同体积的ddH2O，观察成虫翅形态，计算残翅率和翅面积，并在24, 48, 72和96 h检测Atg基因mRNA水平变化。同时，为了明确细胞自噬对家蚕翅发育的影响，选取50～60头同时期生长良好的预蛹期家蚕，在胸腔处注射2 μg的细胞自噬激活剂SMER28(Tianetal., 2011)(SC5502 Beyotime, 上海)，对照组注射相同体积的ddH2O，24，48和72 h后观察羽化后成虫的翅形态，计算残翅率和翅面积。Spautin-1是一种特异的细胞自噬抑制剂，通过调节USP10和USP13的去泛素化活性减少PtdIns3P的水平，进而抑制细胞的自噬(Liuetal., 2011)。为了进一步验证DNA甲基化调控家蚕翅发育是由细胞自噬介导的，选取50～60头预蛹期家蚕，对照组注射相同体积ddH2O，一组实验组注射2 μg 5-aza-dC，另外一组实验组同时注射2 μg 5-aza-dC和2 μg Spautin-1(SC5498 Beyotime, 上海)进行细胞自噬抑制剂挽救实验，24，48和72 h后统计羽化后成虫的残翅率和翅面积。每组实验随机选取9～15头为一个生物学重复，每组进行3个生物学重复。

1.6 溶酶体染色检测DNA甲基化对细胞自噬强度的影响

细胞自噬是一个基于溶酶体的胞内降解过程，胞内组分被自噬小体运输到溶酶体进行降解，从而提供特殊环境下细胞所需要的营养，因此，细胞内溶酶体水平可以反映自噬强度。为了检测5-aza-dC处理是否影响了细胞内的溶酶体水平，在室温下利用LysoTrackerTMGreen DND-26溶酶体绿色荧光探针(L7526, Invitrogen, California, 美国)溶液(LysoTrackerTMGreen DND-26∶PBS=1∶300)对5-aza-dC处理的Bm12细胞(1.2节)和家蚕翅(1.5节)、细胞自噬激活剂SMER28处理的家蚕翅(1.5节)和细胞自噬抑制剂Spautin-1挽救实验家蚕翅(1.5节)进行室温染色20 min，染色结束后PBS洗6次后放到载玻片上，盖上盖玻片，封片处理。盖盖玻片时应注意保护组织的原结构。最后于FV3000共聚焦显微镜(Olympus, 日本)下观察并拍照成像，统计细胞内的溶酶体荧光信号数量。

1.7 RT-qPCR检测5-aza-dC对Atg基因表达的影响

为了检测自噬相关蛋白(Atg)基因(Yang and Klionsky, 2010; Boyaetal., 2013)的表达水平，根据Eastep®Super总RNA提取试剂盒(Promega, Madison, 美国)说明书提取5-aza-dC处理的Bm12细胞(1.2节)和家蚕翅(1.5节)的总RNA。随后，按Evo M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒(Promega, Madison, 美国)说明书进行反转录合成cDNA。利用Primer Premier 5.0设计家蚕翅细胞的内参基因线粒体蛋白49基因(RP49)和细胞自噬相关蛋白基因Atg的RT-qPCR特异引物(表1)，合成后使用Eastep®qPCR Master Mix试剂盒(Promega, Madison, 美国)通过QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System进行RT-qPCR。反应体系: Eastep®qPCR Master Mix 10 μL, Bm12细胞或家蚕翅cDNA模板2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, 无核酸酶水7.2 μL。反应程序: 95℃ 2 min; 95℃ 15 s, 60℃ 30 s, 40个循环后于4℃保持。基因相对表达水平通过2-ΔΔCt方法进行计算(Livak and Schmittgen, 2001)，所有数据为3次技术重复和3次生物学重复。

1.8 数据分析

所有的数据均为平均±标准差。结果的差异显著性由t检验分析得出。

2 结果

2.1 DNA甲基化对家蚕Bm12细胞生长的影响

dot blot检测结果显示(图1: A)，1 μg 5-aza-dC显著降低Bm12细胞基因组5mC的水平，可以作为一种有效的抑制剂进行后续实验。1 μg 5-aza-dC处理12, 24和48 h的Bm12细胞生长受到了明显的影响，与对照组相比Bm12细胞数量分别减少15.85%，19.96%和26.81%(图1: B)，表明DNA甲基化参与调控家蚕细胞的正常生长。

图1 DNA甲基化抑制剂5-aza-dC(1 μg)对家蚕卵巢Bm12细胞生长的影响Fig. 1 Effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dC (1 μg) on the growth of Bombyx mori ovarian Bm12 cellsA: 利用5mC抗体通过dot blot分析5-aza-dC处理后的Bm12细胞中DNA甲基化水平Dot blot analysis of DNA methylation levels in Bm12 cells treated with 5-aza-dC using 5mC antibody. Input: 1.5 μg等量DNA通过核酸染料(GoldView)染色后成像Image of the same amount of DNA (1.5 μg) after staining with nucleic acid dye (GoldView). B: 5-aza-dC处理后显微镜视野下每8 000 μm2的Bm12细胞数量Number of Bm12 cells per 8 000 μm2 in the microscope field after treatment with 5-aza-dC. CK: H2O; 5mC: 5-甲基胞嘧啶5-Methylcytosine. 下同The same below. 图中数据为平均值±标准差；柱上星号示与对照组间的差异显著性(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, t检验)。Data in the figure are mean±SD. Asterisk above bars indicates significance of difference from the control (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, t-test). 下同The same below.

2.2 DNA去甲基化促进家蚕细胞的自噬水平

对转染了3×FLAG-LC3-EGFP超表达载体的Bm12细胞进行5-aza-dC处理，24和48 h后利用FLAG抗体进行Western blot检测(图2: A左)发现，与对照组相比，5-aza-dC处理后的家蚕Bm12细胞内有更多的LC3-I被加工转变为LC3-II，并且处理48 h后细胞中的LC3-II多于处理24 h细胞中的。免疫组化实验也获得了相似的结果(图2: A右)，经过5-aza-dC处理后的细胞内含有更多的呈聚集状的LC3-II蛋白亮点。

溶酶体染色检测结果表明，1 μg 5-aza-dC处理后的家蚕Bm12细胞内的溶酶体荧光信号强度增加(图2: B)，荧光信号数量与对照比较极显著上调(P<0.01)(图2: C)。Atg基因表达量的RT-qPCR检测结果表明，在5-aza-dC处理后的家蚕Bm12细胞内，Atg1,Atg2,Atg6,Atg7,Atg8,Atg9,Atg16和Atg18表达水平与对照比较极显著上调(P<0.01)(图2: D)，表明DNA甲基化可能通过调控细胞自噬来影响细胞的正常生长。

图2 DNA甲基化抑制剂5-aza-dC (1 μg)对家蚕Bm12细胞中自噬的影响Fig. 2 Effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dC (1 μg) on autophagy in Bm12 cells of Bombyx moriA: Western blot (左)和免疫组化(右，箭头指示LC3-Ⅱ)分析5-aza-dC处理对LC3蛋白分型(LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)的影响Western blot (left) and immunohistochemistry (right, arrows pointing LC3-Ⅱ) analyses of LC3 protein typing (LC3-Ⅰ and LC3-Ⅱ) in Bm12 cells treated with 5-aza-dC; B: 5-aza-dC处理对Bm12细胞中溶酶体水平的染色分析Staining analysis of lysosome level in Bm12 cells treated with 5-aza-dC; C: 5-aza-dC处理后Bm12中细胞溶酶体荧光信号数量的统计Statistics of number of fluorescence signals of lysosome in Bm12 cells treated with 5-aza-dC; D: 5-aza-dC处理48 h后Bm12细胞中Atg基因的相对表达水平检测Relative expression levels of Atg genes in Bm12 cells treated with 5-aza-dC for 48 h.

2.3 DNA甲基化参与调控家蚕翅的发育

结果表明，预蛹期注射5-aza-dC后的家蚕成虫出现大量的畸形翅，翅面积减小，厚度变薄(图3: A)，成虫残翅率达到91.67%，而对照组的残翅率仅19.05%(图3: B)。翅面积的统计结果表明，实验组翅面积比对照组减少了66%(图3: C)，说明DNA去甲基化造成家蚕翅的异常发育。检测5-aza-dC处理的家蚕翅中Atg基因的表达水平，如图3(D)所示，Atg1,Atg2,Atg6,Atg7,Atg8,Atg9,Atg16和Atg18在注射后96 h内的表达显著上调(P<0.05)。对注射5-aza-dC后的家蚕翅进行溶酶体染色实验，获得了与在Bm12细胞株中(图2)相似的结果，即DNA去甲基化增强了家蚕蛹翅细胞内的自噬水平(图3: E, F)。

图3 家蚕预蛹注射DNA甲基化抑制剂5-aza-dC (2 μg)后对成虫翅发育的影响Fig. 3 Effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dC (2 μg) injected into prepupaeon the wing development of Bombyx mori adultsA: 5-aza-dC注射后成虫翅的表型Adult wing phenotype after injection with 5-aza-dC; B: 5-aza-dC注射后成虫的残翅率Abnormal wing rate of adult after injection with 5-aza-dC; C: 5-aza-dC注射后成虫的翅面积变化Change of wing area of adult after injection with 5-aza-dC; D: 5-aza-dC注射不同时间后翅中Atg基因的相对表达水平Relative expression levels of Atg genes in wing after injection with 5-aza-dC for different time; E: 5-aza-dC注射不同时间后翅细胞中溶酶体水平的染色分析Staining analysis of lysosome level in wing cells after injection with 5-aza-dC for different time; F: 5-aza-dC注射不同时间后翅细胞溶酶体荧光信号数量的统计Statistics of number of fluorescence signals of lysosome in wing cells after injection with 5-aza-dC for different time.

2.4 DNA甲基化通过细胞自噬影响家蚕翅发育

预蛹期注射细胞自噬激活剂SMER28后24, 48和72 h，与对照组比较，成虫出现了类似注射5-aza-dC后(图3: A)的翅表型，即成虫出现了畸形翅(图4: A)，残翅率从对照的12%升高到87.13%(图4: B)，成虫翅面积降低48.79%(图4: C)，且翅细胞的溶酶体荧光信号强度增加(图4: D)，荧光信号数显著上调(P<0.05)(图4: E)，证明家蚕翅细胞自噬的异常上调确实可以影响翅的正常发育。

图4 家蚕预蛹注射细胞自噬激活剂SMER28(2 μg)对成虫翅发育的影响Fig. 4 Effects of autophagy activator SMER28 (2 μg) injected into prepupae on the wing development of Bombyx mori adultsA: 注射SMER28后成虫翅表型Adult wing phenotype after injection with SMER28; B: 注射SMER28后成虫残翅率变化Change of abnormal wing rate of adult after injection with SMER28; C: 注射SMER28后成虫的翅面积变化Change of wing area of adult after injection with SMER28; D: SMER28注射不同时间后翅细胞中溶酶体水平的染色分析Staining analysis of lysosome level in wing cells after injection with SMER28 for different time; E: SMER28注射不同时间后翅细胞溶酶体荧光信号数量的统计Statistics of number of fluorescence signals of lysosome in wing cells after injection with SMER28 for different time.

为了进一步验证DNA甲基化调控家蚕翅发育是由细胞自噬介导的，我们对5-aza-dC(2 μg)处理的家蚕预蛹进行注射细胞自噬抑制剂Spautin-1(2 μg)的挽救实验。 如图5(A-C)所示，对照组成虫残翅率为16.28%, 5-aza-dC处理组的为92.31%，注射5-aza-dC和Spautin-1的挽救组的为47.7%；对照组翅面积为每翅59.77 mm2, 5-aza-dC组的为每翅20.29 mm2, Spautin-1挽救组的为每翅42.33 mm2。如图5(D和E)所示，与对照组相比5-aza-dC处理后的家蚕翅细胞溶酶体荧光信号强度增加，荧光信号数显著上调(P<0.05)，而注射5-aza-dC和Spautin-1的挽救组家蚕翅细胞内的溶酶体信号强度出现明显的回落，证明细胞自噬抑制剂Spautin-1确实可以挽救由DNA去甲基化引起的细胞自噬。

图5 DNA甲基化通过细胞自噬影响家蚕翅的发育Fig. 5 DNA methylation affects the wing development of Bombyx mori through autophagyA: 5-aza-dC实验组和Spautin-1挽救组的成虫翅表型Adult wing phenotype in 5-aza-dC group and Spautin-1 rescue group; B: 5-aza-dC实验组和Spautin-1挽救组的成虫残翅率变化Change of abnormal wing rate of adult in 5-aza-dC group and Spautin-1 rescue group; C: 5-aza-dC实验组和Spautin-1挽救组的成虫翅面积变化Change of wing area of adult in 5-aza-dC group and Spautin-1 rescue group; D: 处理不同时间后翅细胞中溶酶体水平的染色分析Staining analysis of lysosome level in wing cells after treatment for different time; E: 处理不同时间后翅细胞溶酶体荧光信号数量的统计Statistics of number of fluorescence signals of lysosome in wing cells after treatment for different time. 5-aza-dC: 甲基化抑制剂Methylation inhibitor (2 μg); Spautin-1: 细胞自噬抑制剂Autophagy inhibitor (2 μg).

3 讨论

生物学功能方面的研究表明，尽管昆虫基因组内的DNA甲基化率较低(<1%)(Bewicketal., 2017)，其依然在调控昆虫发育中起着重要作用。然而目前对DNA甲基化影响昆虫发育的研究大都停留在昆虫DNMT基因敲除后的表型观察，DNA甲基化如何具体调控昆虫生长发育的实验研究仍然相对匮乏。本研究选取鳞翅目的模型昆虫家蚕为研究对象，采用DNA甲基化抑制剂5-aza-dC进行DNA甲基化功能研究。5-aza-dC不仅在治疗慢性粒细胞性白血病、骨髓增生异常综合症和急性髓细胞性白血病等临床实践中被应用(Goreetal., 2006; Malik and Cashen, 2014)，还涉及性发育(Ribasetal., 2017)、植物成熟(Zhongetal., 2013)和基因表达(Chiurazzietal., 1999; Slacketal., 1999)等方面的研究。本研究证明1 μg 5-aza-dC处理的家蚕细胞DNA甲基化水平显著下降(图1)，表明5-aza-dC在鳞翅目昆虫细胞中也可以发挥去甲基化的作用。

目前对昆虫DNA甲基化的功能研究表明，DNA甲基化涉及生殖、级型分化、翅发育和性别决定等多种生理生化过程，例如在蝽Oncopeltusfasciatus(Bewicketal., 2019)、家蚕 (Xiangetal., 2013; Lietal., 2020)、丽蝇蛹集金小蜂Nasoniavitripennis(Wangetal., 2013)和德国小蠊Blattellagermanica(Ventós-Alfonsoetal., 2020)中，敲除DNMT基因会致使卵巢和胚胎发育受阻，产卵量/卵孵化率下降和滞育等。对不同种群与性别的蜂群/蚁群的基因组甲基化分析也发现DNA甲基化也可能调控昆虫的社会分工与性别决定(Lykoetal., 2010; Bigotetal., 2011)。我们的早期工作表明DNA甲基化通过抑制几丁质酶而参与调控了家蚕翅的发育(Xuetal., 2020)，本研究发现家蚕预蛹翅在正常发育情况下表现出较低水平的细胞自噬，这与大量关于昆虫变态发育的研究相吻合。昆虫变态发育过程中的中肠、脂肪体和神经等组织细胞都发生着细胞自噬和凋亡(Wuetal., 2006; Weaver and Krasnow, 2008; 张淑尧等, 2019)。家蚕翅原基的细胞凋亡和细胞自噬研究发现，5龄幼虫以及幼虫末期的家蚕翅原基细胞内的凋亡和自噬相关基因普遍具有高水平的表达，如Caspase3,Atg5,Atg6,Atg8和Atg12等；而在家蚕进入预蛹期后，蛹翅细胞内的凋亡和自噬相关基因显著下降，暗示细胞凋亡和自噬可能调控了变态发育时期翅原基向蛹翅的发育，而进入蛹期后其调控作用消失(刘学术等, 2016)。本研究结果发现Bm12细胞内DNA甲基化水平降低导致Atg基因表达上调(图2)，促进家蚕翅的细胞自噬，进而导致翅发育异常，形成畸形翅(图3)，这表明在正常发育情况下DNA甲基化控制细胞的自噬从而使其维持在一定的水平，进而保证家蚕翅发育的有序进行。通过药物处理实验也证明DNA甲基化抑制剂5-aza-dC和细胞自噬激活剂SMER28都可以影响家蚕翅的发育，造成畸形翅。而细胞自噬抑制剂Spautin-1在一定程度上可以挽救5-aza-dC处理造成的翅发育畸形，表明DNA甲基化可以通过调控细胞自噬的形成来参与家蚕翅的发育(图4和5)，因此，我们推测蛹期家蚕翅的正常发育需要DNA甲基化抑制细胞自噬水平，使细胞自噬维持在相对较低的水平。

大量的研究表明细胞自噬是生物体发育的一种保护机制。昆虫相关研究发现20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)对果蝇和家蚕脂肪体和中肠等组织的细胞自噬发生起着重要的调控功能。20E一方面可以通过促进家蚕细胞中的Atg基因表达上调；另一方面又可以通过抑制营养信号mTOR活性而激活家蚕Atg1/Atg13蛋白复合体活性，启动自噬小体的形成，从而诱导幼虫表皮和组织的细胞发生高水平的自噬，执行细胞程序性死亡，保障家蚕正常的变态进程(Leeetal., 2002; Tianetal., 2013; 谢昆等, 2013)。除了激素外，细胞自噬也同样受到DNA甲基化的调控，DNA甲基化不仅可以直接修饰自噬相关基因，还可以影响一些调节自噬的信号分子基因，从而影响它们的转录和随后的细胞自噬(Hu, 2019)。例如，DNA甲基化一方面可以直接修饰Atg1,Atg6,Atg8和LC3等细胞自噬相关基因，通过调控这些基因的转录，进而影响细胞自噬水平，另一方面也可以修饰一些细胞自噬相关的信号分子基因间接影响细胞自噬强度，如NOR1,DAPK和SOX1基因等(Hu, 2019)。同样地，最近的研究也表明，组蛋白修饰和非编码RNA(如microRNA)也是调控细胞自噬的重要表观遗传方式，尤其是H4K16ac和H3K56ac(Füllgrabeetal., 2014; Hu, 2019)。本研究中，对家蚕成虫翅的研究发现DNA去甲基化可以使原本较低水平的细胞自噬大幅度提高，表明DNA甲基化在家蚕变态的关键时期(蛹期)抑制细胞的自噬，避免由于细胞自噬水平过高而影响翅发育的正常进程。然而，DNA甲基化是通过营养、免疫或20E信号通路互作对细胞自噬进行调控，还是直接调控自噬相关基因的转录影响细胞自噬的水平还需要更多的研究来证明。综上所述，DNA甲基化调控细胞自噬的研究尚处于初级阶段，目前只有少数细胞自噬相关基因或信号分子被报道发生DNA甲基化，从而影响自噬水平。我们早期的研究发现DNA甲基化也可以调控家蚕蛹翅中几丁质合成酶和几丁质酶表达来影响几丁质的代谢，从而影响蛹翅的发育(Xuetal., 2017, 2018, 2020)。那么，DNA甲基化是否通过协调细胞自噬和几丁质代谢在家蚕翅细胞的发生，以保证翅的正常发育也有待进一步验证。