复合微生态制剂对断奶仔猪生长性能、免疫机能及盲肠菌群结构的影响

白培钿，孔佳美，裴 婷，程志学，任玉红

(山西农业大学动物医学学院，太谷 030801)

随着中国集约化、规模化养猪业的发展，仔猪采取早期断奶已成为提高母猪生产效率的一种常用手段。因仔猪肠道和免疫系统发育不完善，断奶后仔猪受心理、环境改变和运输等一系列应激，容易引起仔猪早期断奶综合征，导致仔猪生长性能和免疫性能下降，严重影响养猪业的经济效益[1-2]。饲粮中添加抗生素可以减缓仔猪早期断奶综合征[3]，但抗生素的滥用导致耐药菌大量产生、药物在畜禽产品中大量残留，危害人类身体健康[4]。益生菌能改善肠道菌群稳态[5]、恢复肠道上皮黏膜的完整性[6]，提高机体免疫机能[7]，从而改善机体健康水平。酶制剂能补充仔猪机体内消化酶分泌的不足，降解饲料中抗营养因子，提高饲料转化率[8]。作者所在研究团队研制出一种酶与益生菌配伍的复合微生态制剂(专利申请号：202110593392.7)，以期应用于养猪生产中，为养殖业“减抗禁抗”提供新的饲料添加剂。前期研究表明，该复合微生态制剂对BALB/c小鼠的生长具有促进作用，且能增强小鼠免疫功能[9]。本试验进一步探究饲料中添加不同浓度的复合微生态制剂对仔猪生长性能、免疫功能以及盲肠菌群丰度变化的影响，为复合微生态制剂的使用及替代抗生素应用提供科学依据。

1 材料方法

1.1 材料

复合微生态制剂(专利申请号：202110593392.7)：枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、啤酒酵母菌、中性蛋白酶和纤维素酶的混合产品。 其中啤酒酵母菌(LA9380)、枯草芽孢杆菌(LA9480)、中性蛋白酶、纤维素酶购自北京索莱宝科技有限公司；嗜酸乳杆菌(BNCC186469)购自北京北纳创联生物有限公司；3种菌的活性比为1∶1∶1， 总活菌数为1.0×1011CFU/g； 中性蛋白酶的活性为1 840 U/g，纤维素酶的活性为3 220 U/g。

1.2 试验动物与饲养管理

试验选用80头(28±2)日龄、体重相近(9.31 kg±0.52 kg)的断奶仔猪，随机分为5组，每组4个重复，每个重复4头仔猪(公母各半)。 5组饲粮分别为：对照组(CON)，基础饲粮；低、中、高剂量复合微生态制剂组(LOW、MED、HIG)，在基础饲粮中分别添加0.1%、0.2%和0.3%复合微生态制剂(活菌数分别为1×1011、2×1011、3×1011CFU/kg)；抗生素组(ANT)，在基础饲粮中添加75 mg/kg金霉素(金霉素预混剂购自河南正大有限公司，含量为20%)。试验预饲期为7 d，正试期为28 d。 自由采食和饮水，舍内温度24～28 ℃，相对湿度60%～70%。基础饲粮由山西某农牧集团有限公司提供，且不含任何微生态制剂等添加剂成分，其组成和营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平

续表

1.3 样品采集

试验第28天早饲前，每重复随机选取1头体重接近平均值的仔猪，采集前腔静脉血液5 mL，室温静置30 min，3 000 r/min离心10 min后取上清液；采用颈动脉放血法处死采血后的仔猪，打开胸腔和腹腔，取出胸腺和脾脏。于回盲瓣结扎盲肠，快速收集仔猪盲肠内容物于无菌冻存管中，液氮速冻后-80 ℃冰箱保存。

1.4 指标测定与方法

1.4.1 生长性能与腹泻率 于试验开始和试验结束时，对所有仔猪空腹称重。试验期每天记录仔猪采食量。计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。每日09：00、12：00、18：00观察仔猪粪便,以重复为单位计算仔猪腹泻率[10]。

1.4.2 免疫器官指数 胸腺和脾脏称重，计算免疫器官指数。免疫器官指数=免疫器官重(g)/活体重(kg)

1.4.3 血清生化指标 利用全自动血液生化分析仪(Chearay 800，深圳雷杜生命科技)测定血清中血糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)和尿素氮(BUN)含量/活性。

1.4.4 血清免疫指标 免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)采用ELISA法测定，检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。

1.4.5 盲肠菌群16S rRNA基因测序 用DNA抽提试剂盒提取盲肠内容物中细菌总DNA后，采用细菌通用引物：343F(5′-TACGGRAGGCAG-CAG-3′)和798R(5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)，扩增细菌16S rRNA的V3-V4可变区，PCR产物由上海欧易生物医学科技有限公司进行高通量测序。测序得到的原始数据为FASTQ格式，使用Trimmomatic软件对原始双端序列进行去杂。去杂后的双端序列利用FLASH软件进行拼接。采用Vsearch软件，根据序列的相似性(序列相似度≥97%被归为1个OTU)将序列归为多个OTU。使用QIIME软件包挑选出各个OTU的代表序列，进行菌群Alpha多样性分析，计算不同随机抽样下多样性指数。 并基于Silva(version 123)数据库对OTU进行比对注释，得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU代表序列进行分类学分析，在门、科、属水平上统计每个样品的肠道群落组成，并利用欧易云平台(https:∥cloud.oebiotech.cn/task/)绘制物种累计柱状图。

1.5 数据处理与统计分析

试验数据均采用SPSS 26.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准误表示。P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 生长性能和腹泻率

由表2可知，各组仔猪初始体重均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，MED和ANT组仔猪终末体重、ADG和ADFI显著升高(P<0.05)；MED、HIG和ANT组的F/G显著降低(P<0.05)；LOW、MED和ANT组的腹泻率显著降低(P<0.05)。与抗生素组相比，MED组仔猪ADG和ADFI、MED和HIG组F/G以及LOW和MED组仔猪腹泻率均无显著差异(P>0.05)。

表2 不同处理组仔猪生长性能和腹泻率

2.2 免疫器官指数

由表3可知，MED和HIG组仔猪胸腺指数显著高于对照组(P<0.05)；MED组脾脏指数显著高于对照组和抗生素组(P<0.05)，胸腺指数显著高于抗生素组(P<0.05)。

2.3 血清生化指标

由表4可知，与对照组相比，LOW、MED和HIG组血清HDL含量显著上升(P<0.05)；LOW、HIG和ANT组BUN水平显著下降(P<0.05)；MED和ANT组ALB含量显著上升(P<0.05)；LOW、MED和ANT组AST活性显著下降(P<0.05)。抗生素组LDH活性相较于其他处理组显著升高(P<0.05)。

2.4 血清免疫指标

由表5可知，与对照组相比，LOW、MED和ANT组血清IgG含量显著升高(P<0.05)；MED和ANT组血清IgA与IgM含量显著升高(P<0.05)。HIG组血清IgG含量显著低于抗生素组(P<0.05)，LOW和MED组血清IgG含量、MED组血清IgA与IgM含量均与抗生素组无显著差异(P>0.05)。

表3 不同处理组仔猪免疫器官指数

表4 不同处理组仔猪血清生化指标测定结果

表5 不同处理组仔猪血清免疫指标测定结果

2.5 盲肠菌群结构

2.5.1 Alpha多样性 复合微生态制剂对仔猪盲肠菌群Alpha多样性的影响见表6。由表6可知，5个处理组间的Coverage和Simpson指数没有显著差异(P>0.05)；LOW和HIG组的Chao1指数显著高于对照组(P<0.05)；LOW组的Shannon指数显著高于对照组(P<0.05)。

表6 不同处理组仔猪盲肠内容物菌群Alpha多样性指数

2.5.2 盲肠菌群丰度 由图1A可知，在门水平上，拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)是5个处理组的优势菌群。由表7可知，与对照组相比，LOW、MED和ANT组厚壁菌门相对丰度显著升高(P<0.05)，LOW和MED组拟杆菌门相对丰度显著下降(P<0.05)；HIG和ANT组变形菌门相对丰度显著下降(P<0.05)；LOW、MED、HIG和ANT组柔壁菌门(Tenericutes)相对丰度显著下降(P<0.05)。由图1B可知，在科水平上，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、韦荣氏菌科(Veillonellaceae)及Muribaculaceae是各组仔猪盲肠的优势菌群。由表7可知，相较于对照组，HIG组普雷沃氏菌科、LOW组瘤胃菌科及LOW、MED、HIG和ANT组乳杆菌科相对丰度均显著上升(P<0.05)，同时这4组盲肠理研菌科(Rikenellaceae)与Tannerellaceae相对丰度均显著下降(P<0.05)；相较于对照组和抗生素组，LOW和HIG组假单胞菌科(Pseudomonadaceae)相对丰度显著下降(P<0.05)，相较于抗生素组，LOW组瘤胃菌科相对丰度显著上升(P<0.05)。由图1C可知，在属水平上，普氏菌属_9(Prevotella_9)、Agathobacter、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、粪杆菌属(Faecalibacterium)是5个处理组的优势菌群。由表7可知，与对照组相比，HIG组拟普雷沃菌属相对丰度显著上升(P<0.05)；LOW和ANT组普雷沃氏菌属_1(Prevotella_1)相对丰度显著下降(P<0.05)；LOW、MED、HIG和ANT组乳杆菌属相对丰度显著上升(P<0.05)，而Prevotellaceae_UCG-001和弯曲杆菌属(Campylobacter)相对丰度显著下降(P<0.05)；MED、HIG和ANT组毛螺菌属(Lachnospira)相对丰度显著下降(P<0.05)；LOW、HIG和ANT组粪杆菌属相对丰度显著上升(P<0.05)；LOW组Subdoligranulum相对丰度显著上升(P<0.05)。

A～C，分别表示仔猪盲肠菌群门水平、科水平和属水平相对丰度A-C，The relative abundance of piglet caecal flora at phylum level,family level and genus level,respectively图1 不同处理组仔猪盲肠菌群相对丰度Fig.1 The relative abundance of cecal flora of piglets in different groups

表7 不同处理组仔猪盲肠内容物差异菌相对丰度

续表

3 讨 论

益生菌能通过改善仔猪肠道消化吸收能力、提高养分利用率、抑制肠道中病原菌的生长而改善肠道健康，从而提高仔猪生长性能，降低腹泻率[5-7,11]。酶制剂能加快消化道内养分的消化、吸收和利用，并且可以消除饲料中抗营养因子，从而改善仔猪的生长性能[8,12]。饲粮中添加复合微生态制剂可以提高仔猪ADG和ADFI，降低F/G和腹泻率[13-14]。本研究结果表明，MED和ANT组均显著提高了仔猪终末体重、ADG和ADFI，降低F/G和腹泻率，这表明适宜添加量的益生菌和酶制剂可共同作用提高仔猪生长性能。而本研究中，饲粮中添加0.1%或0.3%复合微生态制剂，仔猪终末体重、ADG和ADFI相较于对照组均差异不显著，未达到预期效果，其原因可能是复合微生态制剂添加量未达到适合浓度时，对仔猪生长性能影响较小，而添加量过高可能会降低饲粮的pH[15]，从而影响饲粮适口性[16-17]，导致仔猪采食量下降。

免疫器官指数是反映机体免疫力的重要指标。胸腺、脾脏是机体重要的免疫器官，参与机体体液免疫和细胞免疫[18]。陈振等[19]研究表明，饲粮中添加复合益生菌可提高仔猪免疫器官指数，提高免疫力。本试验中饲粮添加不同剂量的复合微生态制剂均可提高仔猪免疫器官指数，且MED组胸腺指数和脾脏指数相较于对照组与ANT组均显著上升，表明饲粮中添加0.2%复合微生态制剂可以促进仔猪免疫器官的生长和发育，增强仔猪的免疫机能。

研究表明，饲粮中添加益生菌可显著降低仔猪血清中ALT和AST活性[20-21]，与本研究结果一致。在本研究中，添加不同浓度复合微生态制剂后，仔猪血清中AST、ALT和ALP活性均有不同程度降低，其中MED和ANT组血清中AST活性显著降低。ALB的含量可反映肝脏合成蛋白质的能力[22]，同时ALB作为血液中重要组成部分，在转运代谢物、营养物质和维持胶体渗透压方面有重要作用[23]。本研究结果表明，与对照组相比，MED与ANT组血清ALB含量显著提高，与贺长青等[22]研究结果基本一致。血清TC、TG、LDL和HDL含量变化能反映机体脂质代谢情况[24]。本研究结果表明，复合微生态制剂添加组血清HDL含量显著高于对照组与抗生素组，表明复合微生态制剂能改善仔猪血液脂质代谢，与任红立等[25]结果基本一致。

免疫球蛋白是淋巴细胞受到抗原刺激产生的一种蛋白质，血清中IgG、IgM、IgA能够与抗原特异性结合，其在血清中的含量可以衡量机体的免疫功能[26]。饲粮中添加复合微生态制剂能提高仔猪血清中IgG、IgM和IgA的含量，增强仔猪免疫力[26-27]。本研究结果显示，饲粮添加不同浓度复合微生态制剂均能提高仔猪血清IgG、IgM和IgA的含量，与谢大识等[14]结果一致，其中，MED和ANT组IgG、IgM和IgA的含量上升幅度较高。以上结果表明，复合微生态制剂能提高仔猪的血清免疫球蛋白含量，改善仔猪免疫功能。

动物肠道中有数量庞大且复杂多样的菌群，肠道菌群的动态平衡对宿主营养消化和健康起着重要作用[28-29]。在菌群多样性分析过程中，Coverage指数值越高，序列被测出的概率越高；Chao1指数和Shannon指数值越大，群落丰度和多样性越高[28]。在本试验中，LOW组Chao1指数和Shannon指数均显著高于对照组，表明LOW组盲肠菌群多样性显著高于对照组，与王四新等[28]研究结果一致。厚壁菌门具有降解多糖和促进机体能量吸收的作用[30-31]，在断奶仔猪肠道中起重要作用。本研究结果表明，仔猪盲肠菌群以厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门为主，与对照组和抗生素组相比，LOW、MED和ANT组厚壁菌门相对丰度显著升高。变形菌门中如大肠杆菌、沙门氏菌等都有可能引起仔猪腹泻，该菌门的丰度下降通常被认为有利于肠道健康[30]。本研究中，HIG与ANT组变形菌门在盲肠中的相对丰度相较于对照组显著降低，且二者的降低程度相似。与对照组相比，LOW组瘤胃菌科和HIG组拟普雷沃菌属相对丰度显著上升。瘤胃菌科细菌能够发酵肠道内的纤维素[32]，产生短链脂肪酸(SCFAs)，拟普雷沃菌属属于拟杆菌门，在肠道内可以产生SCFAs[33]，SCFAs含量增加有利于仔猪肠道健康，降低仔猪腹泻率[34]。仔猪断奶后，肠道内乳酸菌的比例迅速降低[35]。乳酸菌可通过自身及生长代谢产生抑菌物质，抑制致病菌的繁殖，对改善肠道微生物菌群结构具有一定作用[36]。本研究中，相较于对照组，饲粮中添加复合微生态制剂后盲肠乳杆菌科与乳杆菌属菌群相对丰度上升，与朱佳文等[33]研究结果相似。粪杆菌属细菌能降解膳食纤维产生丁酸盐，缓解组织炎症，增加肠道完整性[37-38]。本试验中，LOW、HIG和ANT组粪杆菌属相对丰度相较于对照组均显著上升，有利于仔猪肠道健康；同时，饲喂复合微生态制剂后盲肠中弯曲杆菌属和毛螺菌属相对丰度降低，并且LOW和HIG组盲肠中假单胞菌科菌群相对丰度降低。弯曲杆菌[39]和毛螺菌属[40]的上调均能引起仔猪腹泻，假单胞菌是引起急性和慢性感染的主要病原体，尤其是在免疫功能低下的人群中较为常见[41]。综上所述，饲粮中添加复合微生态制剂可改善仔猪盲肠菌群结构。

4 结 论

在本试验条件下，饲粮中添加0.2%复合微生态制剂(活菌数为2×1011CFU/kg)能够一定程度上提高断奶仔猪的ADG和ADFI，降低F/G和腹泻率；提高免疫器官指数和血清中ALB、HDL、IgG、IgA和IgM的含量，降低AST活性；改善盲肠微生物群落结构，其作用效果与抗生素相似，具有替抗潜力。