蟾皮标准关键控制指标的研究

程民 代磊 张婷

摘要：目的：建立蟾皮标准的关键控制指标。方法：采用TCL法鉴别蟾皮中华蟾酥毒基，依法测定重金属及有害元素、33种禁用农药、黄曲霉毒素等，UV法测定游离总生物碱的含量。结果：薄层鉴别特征显著，药材重金属及有害元素不合格率为0.07%，33种禁用农药和黄曲霉毒素均合格，游离总生物碱含量在0.05%～0.26%之间。结论：该方法简单可行，专属性强，重复性好，可用于蟾皮的质量控制。

关键词：蟾皮;华蟾酥毒基;游离总生物碱

【中图分类号】 Q969.35+8.6    【文献标识码】 A      【文章编号】2107-2306（2022）03--02

蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮[1]，始载于《本草纲目拾遗》[2]，别名有蛤蚆皮、癞蟆皮、干蟾皮等，于夏秋季节捕捉，杀死或烫死，剥取外皮，贴于板上或撑开、干燥，具有清热解毒，利水消胀的功效[3]，用于小儿疳积、咽喉肿痛、肿瘤。目前蟾皮的质量标准无国家标准，仅有几个省的地方标准收载且质控指标少、简单，标准不能全面反映和控制蟾皮质量的现状，本研究采用UV法对5-羟色胺成分进行定量分析，TLC法对华蟾酥毒基进行鉴别，重点解决吲哚类生物碱成分质量控制方法的建立，同时按《中国药典》2020年版四部方法对33种禁用农药、重金属及有害元素、黄曲霉毒素等进行考察，最终形成蟾皮多成分控制系统的科学、实用、先进、可控的蟾皮药材质量标准。

1 材料

1.1  主要仪器

Evolution220紫外可见分光光度计（赛默飞世尔科技（中国）有限公司），Agilent 8890-7000D气相色谱-三重四极杆串联质谱仪（安捷伦科技公司），Agilent 1290-6470液相色谱-三重四极杆串联质谱仪（安捷伦科技公司），Agilent 7800电感耦合等离子体质谱仪（安捷伦科技公司），Evolution220紫外可见分光光度计（赛默飞世尔科技（中国）有限公司），Linomat 5卡玛半自动点样仪（CAMAG），TLC Visualizer卡玛薄层色谱数码成像系统（CAMAG），MARS6微波消解仪（培安有限公司），XPE56分析天平（梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

蟾皮对照药材（批号：120963-201405，来源中国食品药品检定研究院），华蟾酥毒基对照品（批号：110803-201807，来源：中国食品药品检定研究院），33种禁用农药混合对照品（批号：S057535，来源：天津阿尔塔科技有限公司），30种禁用农药混合对照品（批号：S062923，来源：天津阿尔塔科技有限公司），磷酸三苯酯对照品（批号：120132-202009，来源：上海奈启生物科技有限公司），黄曲霉毒素混合溶液（批号：61001-202006，来源：中国食品药品检定研究院），5-羟色胺盐酸盐对照品（批号：111656-202002，纯度：97.8%，来源：中国食品药品检定研究院）;硅胶GF254板（TLC Silica gel 60 F254）（规格：10cm×20cm，厂家：Merck）;盐酸、冰醋酸、对二甲氨基苯甲醛等试剂均为分析纯。

15批蟾皮均经安徽省中药材标准编制工作专家委员会鉴定，见表1。

2 方法与结果

2.1薄层鉴别

取本品粗粉1.0g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取干蟾皮对照药材1.0g，同法制成对照药材溶液。另取华蟾酥毒基对照品，加甲醇制成1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2020年版四部 通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-丙酮（4：3：3）为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。详见图1。

2.2重金属及有害元素

按《中国药典》2020年版四部2321铅、镉、砷、汞、铜测定法中的电感耦合等离子体质谱法对15个批次的样品进行检查，15批样品中有一批超出《中国药典》2020年版重金属及有害元素标准要求，超标元素为汞元素，不合格率为0.07%，结果见表2。

2.3 33种禁用农药

按《中国药典》2020年版四部通则2341农药残留量测定法第五法（气相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-串联质谱法）对15个批次的样品进行检查，15个批次的蟾皮按照《中国药典》2020年版的标准禁用农药残留项均合格，没有超标的存在，但蟾皮中禁用农药检出率为86.7%，该现象可能是蟾蜍在未代谢掉的环境中进食产生了富集现象，结果见表2。

2.4 黄曲霉毒素

按《中国药典》2020年版四部通则2351真菌毒素测定法中的第二法（液相色谱-串联质谱法）对15个批次的样品进行检查，15批蟾皮药材黄曲霉毒素均为未检出，结果见表2。

2.5 游離总生物碱含量测定

2.5.1检测波长的选择

根据蟾皮药材所含成分的理化特性，以及《中国药典》2020年版四部、各地方标准中记载、相关文献报道对蟾皮的研究，使用紫外-可见分光光度计为测定仪器，选定555nm为检测波长。

2.5.2 显色剂用量的选择

制备样品做反应液用量的考察，分别取1.0 ml， 1. 5 ml， 2.0 ml样品液，再分别加1%冰醋酸溶液（1.0 ml， 0. 5 ml， 0 ml）补至2 ml，加入15%对二甲氨基苯甲醛盐酸溶液2 ml，反应30min 后测定，结果3种测定结果近似，无显著性差异，为了减少操作步骤和误差，最终确定选用2.0 ml样品液加入反应液2.0 ml进行反应。

2.5.3 样品的提取方法

取本品粗粉（过10目筛）约300 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加1%冰醋酸溶液25ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz） 30分钟，取出，放冷，再称定重量，用1%冰醋酸溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5.4 样品浓度与峰面积之间的线性关系考察

精密称取5-羟色胺盐酸盐对照品，用水配制成浓度为0.072mg/ml的浓溶液，摇匀。精密量取0.25 ml、0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、4.0 ml置5ml量瓶中，加入水至刻度，摇匀。取2 ml上述对照品溶液，加15%对二甲氨基苯甲醛盐酸（2→3）溶液2 ml，摇匀，室温放置30分钟，照紫外-可见分光光度法 （通则0401），以相应试剂空白，在555nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：y=0.07392+0.01840x，R=0.9967。

2.5.5  精密度试验

精密吸取同一浓度对照品溶液，重复测定6次，进行精密度试验，结果5-羟色胺RSD为0.05%，表明精密度良好。

2.5.6 样品稳定性试验

按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，室温下自然放置，分别于0、15、30、45、60、90、120分钟测定含量，结果样品放置2小时后，RSD为3.08%;0-45分钟的RSD为1.72%，故样品在45分钟内稳定性良好。

2.5.7  样品重复性试验

分别精密称取6份，按照上述样品的提取处理方法，对样品进行提取处理。结果5-羟色胺RSD为0.61%，表明该方法有良好的重复性。

2.5.8  回收率试验

采用加样回收法，精密称取5份已知含量同一批号的样品150 mg，分别精密加入对照品溶液（0.072 mg/ml）5 ml，各加入20 ml1%冰醋酸溶液，称重。超声30 min，补足失重。滤纸过滤后，水性过滤头过滤，各取2 ml上述续滤液，加15%对二甲氨基苯甲醛盐酸（2→3）溶液2 ml，摇匀，室温放置30分钟，照紫外-可见分光光度法 （ 通则0401 ），以相应试剂空白，在555nm的波长处测定吸收度，结果平均回收率为98.57%，相对标准偏差为2.03%，，表明方法准确性良好，结果见表3。

2.5.9  样品含量测定

按上述方法测定各批号蟾皮中游离总生物碱含量，计算含量结果，即得。结果见表7。

3讨论

3.1 TCL条件的筛选 本实验根据文献报道[4][5][6]，选用脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、沙蟾毒精对照品，比较了三氯甲烷-甲醇（9：1）和环己烷-三氯甲烷-丙酮（4：3：3）展开剂系统，对供试品溶液制备方法、不同点样量、不同点样方式、3种不同厂家薄层版、不同温度不同湿度、预平衡进行了考察，结果个别供试品色谱中，在与脂蟾毒配基、沙蟾毒精对照品色谱相应的位置上，荧光斑点不清晰，分析原因为脂蟾毒配基、沙蟾毒精在蟾皮中含量低，受蟾皮加工方式的影响，会导致脂蟾毒配基、沙蟾毒精在蟾皮中批间差异大，故将此薄层色谱鉴别方法中仅选用华蟾酥毒基对照品，结果该方法专属性、耐用性强，薄层鉴别特征显著。

3.2 超声提取时间的选择

分别精密称取相同重量样品3份，分别加入25ml 1%冰醋酸溶液，称重，以上各样按不同超声时间处理，分别为30 min， 60 min和90 min，超声，补足失重，滤纸滤过，0.45 μm过滤头滤过，各取2 ml续滤液，分别加入15%对二甲氨基苯甲醛盐酸溶液2 ml，反应30min 后测定，于紫外-分光光度计555nm处测定相应吸光度。结果超声30分钟和60分钟含量近似，因此选取超声提取30 min。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[S].北京：中国医药科技出版社，2020：558.

[2]周谧，傅兴圣.不同采收情况与干蟾皮中酯类成分含量对比研究[J].海峡医药，2018，30（10）：41-44.

[3]李宝晶，，吳炎，王磊，等.蟾皮中的蟾蜍甾烯类成分及其细胞毒活性研究[J].中草药，2021，52（10）：2876-2883.

[4]周谧，傅兴圣，朱琳，等.干蟾皮药材质量标准研究[J].药学与临床研究，2017，25（3）：209-212.

[5]喻昌燕，孟令杰，姜念，等.蟾皮化学成分和药理活性的研究进展[J].中草药，2021，52（4）：1206-1220.

[6]焦安妮，于敏，李蕾，等.高效液相色谱-串联质谱法测定干蟾皮中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基[J].中草药，2019，50（15）：3687-3690.