小檗碱对脂多糖诱导的小鼠小肠炎症的保护作用

李慧 任思齐 周燕楠 胡梦婷 卜妮妮 赵鑫原 段慧琴/北京农学院动物科学技术学院 102206

脂多糖（LPS）是以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌的主要致病物质，其具有广泛的生物活性，能引起严重的炎症级联反应，进而损伤多个脏器。

小檗碱（Berberine，BBR）是存在于毛茛科及小檗科等植物根茎中的一种异喹啉类生物碱，具有清热解毒的功效，毒副作用小。小檗碱多被使用在清热解毒方和抗菌消炎的方剂中，在治疗与预防家畜肠炎、胃溃疡、胃炎、菌痢消化道疾病方面有很突出的作用，具体作用机制虽有研究但还不够明确。本研究用小檗碱预作用于小鼠，再用LPS 诱导小鼠小肠急性炎症，研究小檗碱对小肠的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂盐酸小檗碱标准品（HPLC≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司，将小檗碱溶于生理盐水，配制成2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL 药液；LPS（大肠杆菌血清型为 O55：B5）购自美国 Sigma-Aldrich 公司，以生理盐水溶解LPS 配成1mg/mL。

1.2 试验动物SPF 级昆明小鼠，50 只，体重20±2g，购自北京市海淀区兴隆实验动物养殖场。试验前适应性饲养一周，自由采食与饮水。

1.3 试验方法

1.3.1 动物分组与处理将小鼠随机分为小檗碱低剂量（25mg/kg）+LPS 组、小檗碱中剂量（50mg/kg）+LPS 组、小檗碱高剂量（100mg/kg）+LPS 组、阴性对照组、LPS 模型对照组。小檗碱低中高剂量组连续给药灌胃3d，空白组和模型组灌胃生理盐水10mL/kg。末次给药后1 小时小檗碱组和LPS 模型对照组腹腔注射10mg/kg LPS，以建立小鼠小肠炎症模型，阴性对照组腹腔注射10mL/kg 生理盐水，并禁食、自由饮水，观察小鼠精神状态、运动状态。12h 后处死。

1.3.2 测定指标及方法

1.3.2.1 一般行为指标 对小鼠精神状态、运动状态和饮水情况等一般行为指标进行观察并记录。

1.3.2.2 小肠组织形态学观察 打开腹腔后观察小肠大体形态变化，取十二指肠、空肠和回肠样品常规脱水透明，包埋于石蜡，切片（5μm），进行 HE 染色，染色切片光镜下观察。

1.3.2.3 ELISA 法测定小鼠肠组织中IL-6、IL-1β 水平 病变肠组织切割标本后，称取重量，用液氮迅速冷冻，加入一定量的PBS（pH7.4），用手工玻璃匀浆其将标本匀浆充分，3000r/min 离心20 分钟，仔细收集上清。按照ELISA 试剂盒说明书检测肠组织中IL-6、IL-1β 水平。

1.3.2.4 免疫印迹法测定小鼠十二指肠中 MD-2、TLR4 蛋白的表达 病变肠组织切割标本后，称取重量，用液氮迅速冷冻，加入一定量的RIPA（含PMSF）裂解提取蛋白。所得蛋白样本以12% SDS-PAGE 进行电泳并将目的蛋白转移至PVDF 膜。5%脱脂奶粉封闭2h 后，分别加入MD-2、TLR4、NF-κB、β-actin 抗体，4℃孵育过夜。之后加入HRP 标记二抗室温孵育2h。加入ECL 显色液并曝光条带。

1.4 统计分析用Graph Pad Prism 8 统计软件进行数据分析，计量数据以均值±标准差（Mean±SD）表示，用单因素方差分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 一般行为指标观察腹腔注射LPS 3h 后LPS 模型对照组开始出现排泄球状便、软便，扎堆，精神萎靡；7h 后排稀便，饮水减少，行动缓慢，眼角出现明显白色粘稠分泌物；10h 后小鼠体态呈佝偻状，眼睛分泌物粘稠凝结于眼表，睁眼障碍，不见饮水行为，反应迟钝，黄色稀便黏着于肛门口。BBR 各组较LPS 组晚出现上述异常行为。12h 期间阴性对照组未表现出异常行为。

2.2 小肠组织形态学观察打开腹腔后阴性对照组小肠颜色正常，形态完整、整齐，未见水肿与出血。LPS 模型组十二指肠及空肠前段有明显水肿，肠腔扩张，颜色变深，胀气，空肠及回肠肠道内粪便硬结。BBR 各组十二指肠均可见轻微水肿胀气，颜色稍变深。肉眼可见各组十二指肠均有病变。

小肠切片HE 染色显示阴性对照组小肠绒毛结构完整，排列紧密，无明显病变；LPS 模型组肠绒毛部分破坏断裂，肠道细胞排列紊乱，细胞肿胀明显，固有层乃至隐窝出血，炎症细胞浸润；用药组较模型组固有层红细胞减少，绒毛破坏明显减轻（图1）。

图1 各组小鼠小肠切片HE 染色（200×）

2.3 小鼠十二指肠中IL-1β、IL-6 含量测定LPS 模型组与阴性对照组相比，十二指肠中IL-1β、IL-6 含量明显升高，差异极显著（**P ＜0.01）；小檗碱组与LPS 模型组相比，十二指肠中IL-1β、IL-6 含量均极显著低于LPS 模型组（**P＜0.01），其中100mg/kg·d 小檗碱组效果最好（图2）。

图2 各组小鼠十二指肠中IL-1β 及IL-6 含量

2.4 小鼠十二指肠MD-2、TLR4、NF-κB 蛋白含量测定对不同处理组小鼠十二指肠中MD-2、TLR4 及NF-κB 蛋白的含量通过免疫印迹法检测，以β-actin 为内参，用Image J 进行灰度分析。统计结果显示LPS 模型组与阴性对照组相比，十二指肠中MD-2、TLR4、NF-κB 相对表达量明显升高，差异极显著（**P ＜0.01）；小檗碱组与LPS 模型组相比，十二指肠中MD-2、TLR4 相对表达量均极显著降低（**P＜0.01)，50mg/kg·d 和100mg/kg·d 小檗碱组极显著降低NF-κB 表达量（**P＜0.01),其中100mg/kg·d 小檗碱组效果最好（图3）。

图3 各组小鼠十二指肠MD-2、TLR4、NF-κB 相对表达量

3 讨论

LPS 在体内首先被LPS 结合蛋白(LBP)识别形成复合物，继而在辅助蛋白CDl4 的帮助下转运至细胞表面由髓样分化因子2(MD-2)和Toll 样受体4(TLR4)组成的复合受体，并激活TLR4 依赖的炎症信号通路，激活下游MyD88 依赖和TRIF 依赖的信号通路，最终导致核因子-KB（NF-KB）和活化蛋白-1（AP-1）等转录因子活化从而开启下游的炎症因子、粘附分子和趋化因子等基因的转录和表达，造成大量的炎症介质IL-1β、IL-6 等的释放，迸而损伤多个脏器，引发动物细菌性疾病。前期课题组研究表明小檗碱在细胞层面有很好的抗炎活性，表现在对LPS 诱导的急性炎性反应及其传导信号通路的抑制。本次研究在动物层面通过检测TLR4、MD-2、NF-κB 蛋白及下游炎症因子IL-1β、IL-6 验证小檗碱对LPS诱导的小鼠炎症反应的缓解作用，初步探究小檗碱抗内毒素的作用机制可能是通过TLR4/MD-2/NF-κB 信号通路上的蛋白表达，从而减少炎症因子的分泌，保护肠道。