CLCF1在肾移植功能恢复延迟中的表达变化

仇炜 王思旭 胡新一 田野 苏明

移植肾功能恢复延迟(delayed graft function,DGF)是肾移植术后常见的并发症，其危害较大，并导致患者住院时间延长以及医疗费用的增加，更为严重的是DGF可显著缩短移植肾的存活期，严重降低肾移植效果。DGF发病原因目前尚不明确，可能与缺血/再灌注损伤有关[1,2]。因此，发现新的DGF相关因子对于DGF的诊断和治疗有重要意义。心肌营养素样细胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1，CLCF1)属于白介素-6(interleukin-6，IL-6)家族成员，是一种分泌型细胞因子。该因子与细胞因子受体样因子1(cytokine receptor-like factor 1，CRLF1)或可溶性睫状神经营养因子受体(soluble ciliary neurotrophic factor receptor，sCNTFR)相结合，并形成信号转导复合物激活STAT3信号通路[3,4]。有研究在DGF中进行了筛选，发现CLCF1可能在DGF肾组织中表达上调。然而，CLCF1与DGF之间的关系尚不明确。本研究在肾移植术后并发DGF的患者中通过研究CLCF1的表达变化，分析该因子与DGF之间的关系，旨在为肾移植术后DGF的防治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 患者均来自于2016年1月至2019年1月在首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科行肾移植手术的受者，均于术后24 h内采集静脉血，立刻在3 000 r/min条件下离心5 min，分离血浆冻存于-80℃保存备用。术后每日监测血清肌酐变化。肾移植术后血清肌酐无显著改善者为DGF组(n=10)。即刻移植肾功能恢复(immediate graft function，IGF)患者为IGF组(n=15)。2组患者年龄、性别比、体重，高血压、糖尿病发病率，2组供者年龄、性别比、冷缺血时间、受者移植前血肌酐水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

1.2 酶联免疫吸附实验 采用双抗体夹心法人酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Cusabio，武汉)测定血浆中CLCF1表达。操作方法按照试剂商的说明进行。简言之，将血浆样品加到抗CLCF1抗体预包被的96孔板上，并在37℃下培养2 h。随后弃去上清，加入生物素结合抗体替换上清液并在37℃下孵育1 h。随后漂洗孔板，加入HRP标记的亲和素，在37℃下孵育1 h。漂洗孔板5次后，加入TMB底物，并在37℃下反应1 h，然后加入终止液终止反应。采用酶标仪测定450 nm处光密度值，根据标准曲线计算CLCF1水平。

表1 2组基线资料比较

1.3 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件，数据采用中位数(四分位距)表示。采用Mann-Whitney U检验分析2组间的差异。以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者血清肌酐水平变化比较 DGF组患者血清肌酐无下降趋势，而IGF患者血肌酐水平有较大降幅。见表2，图1。

表2 2组肾移植受者术前及术后血清肌酐动态变化比较

图1 IGF和DGF肾移植受者血肌酐变化表

2.2 2组血浆CLCF1表达水平在肾移植患者中上调 我们检测了移植后24 h内所有肾移植受者血清CLCF1的变化。与IGF受者相比，DGF受者的血浆CLCF1显著增加(2.53 ng/ml vs 1.01 ng/ml)。提示CLCF1与肾移植DGF有关。见图2，表3。

2.3 血浆CLCF1水平与肾移植患者血肌酐下降水平之间的关系 术后第1到第5天血浆CLCF1水平与血肌酐下降值之间的关系，血肌酐负值越大提示肾功能恢复越好。结果可见，在术后第2、4、5天，血肌酐下

图2 血浆CLCF1表达水平与肾移植DGF之间的关系

表3 25例肾移植受者术后24 h内血浆CLCF1水平比较 ng/ml,M(P25，P75)

降值(ΔCr)与CLCF1呈正相关(r值分别为0.444、0.447和0.639，P<0.05)，即CLCF1越大血肌酐下降幅度越小，肾功能恢复越差。由此提示，CLCF1是肾移植术后肾功能恢复的标志性分子。见图3。

图3 血浆CLCF1水平与血肌酐变化的相关性；纵轴为肾移植术后第1到第5天血肌酐与术前血肌酐的差值(单位：μmol/L)，横轴为血浆CLCF1浓度，采用Spearman相关分析，相关系数ρ及P值如图所示

3 讨论

肾移植是终末期肾病最为有效的治疗方法之一。我国每年等待肾移植治疗的患者群体很大，而肾源相对不足的情况下导致了现阶段的供需矛盾。供肾标准的扩大化是解决当前供需矛盾的有效策略。因此，维持移植肾的生存期对于节省医疗资料开支有至关重要的作用。但是由于多种原因，部分患者术后会产生DGF，严重影响肾移植治疗效果。因此，找到与肾移植DGF相关的因子，对于该病的防治有至关重要的意义。本研究发现，CLCF1是一个新的DGF相关分子，其表达在DGF患者血浆中呈上调趋势，这可能为肾移植术后DGF的防治提供有力的实验证据。

DGF的发生可能与多种危险因素有关。其中，缺血再灌注损伤是可直接导致DGF的独立危险因素。缺血再灌注损伤时可导致组织器官供氧不足，并通过促进糖酵解作用而引起细胞酸中毒[5]。缺血再灌注损伤还可诱导细胞死亡，并加重炎症和氧化损伤[6]，而由于局部聚集的白细胞可黏附在微血管内，引起炎性反应[7]。这些变化增强了活性氧的释放，从而促进炎性介质和蛋白水解酶的产生[8]，并最终导致DGF。

CLCF1是IL-6家族成员，广泛表达于淋巴结、脾脏等次级淋巴器官及骨髓、卵巢、胎盘、肾脏、垂体等多种器官。CLCF1的分泌需要与CRLF1或sCNTFR相互作用以异源二聚体形式释放[9]，并与细胞表面CNTFR结合，进而激活STAT3和ERK1/2/MAPK通路[9]。多种促炎因子，如TNF-α、INF-γ和IL-6等均可上调CRLF表达，并增强CLCF1的作用[10]。人类CLCF1或CRLF1基因突变导致CISS，而小鼠CLCF1的缺失则无法成活[11]。最近研究表明，CLCF1参与间充质干细胞向成骨细胞分化[21]以及巨噬细胞-泡沫细胞的转化[12]。而在肾移植中，CLCF1可触发肾移植后局灶节段性肾小球硬化的复发[13]。在本研究中，我们观察到DGF肾移植受者的血浆CLCF1水平显著上调，提示CLCF1可能在肾移植术后DGF中有重要作用，而该分子对肾移植DGF的具体作用机制尚需进一步研究。

综上所述，CLCF1是肾移植术后DGF中上调表达的分子，可能在肾移植DGF诊断及治疗过程中有重要意义。