谷丙转氨酶持续正常HBeAg阳性慢性HBV感染者肝组织学病变的独立危险因素探讨及无创模型建立

刘勇，邹亚文，孙嬴，王雪梅，余祖江

（郑州大学第一附属医院 感染科，河南 郑州 450000）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一个全球性的公共卫生问题，世界范围约有2.5亿乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）携带者［1］。据统计，我国约有7 000万例慢性HBV感染者，是全球HBV感染人数最多的国家［2］。中国慢性乙型肝炎防治指南（2019版）［3］推荐意见指出：血清HBV DNA阳性、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）大于正常值上限（upper limit of normal，ULN）且排除其他原因所致者，均应进行抗病毒治疗。对于ALT正常乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）阳性慢性HBV感染者，既往观念认为患者处于免疫耐受期，肝组织通常无显著炎症和纤维化，可暂不启动抗病毒治疗。然而，近年来的研究表明，在ALT正常或轻度升高的慢性HBV感染者中，仍有相当比例的患者存在显著肝组织学病变［炎症活动度≥G2和（或）纤维化程度≥S2］［4－7］，这部分患者同样有较高风险进展为肝硬化、肝细胞癌和终末期肝病［8］。因此，准确评估ALT正常的慢性HBV感染者肝组织病变程度，对于是否启动抗病毒治疗有重要意义［9］。

肝组织活检是评估肝组织学病变的金标准［10－11］，但肝活检是一项有创伤性的检查，并且有潜在出血风险和取样误差等缺点［12］。因此，肝活检在临床上的应用受到了限制。近些年，多种肝组织无创评估方法，如血清无创模型和瞬时弹性超声（transient elastography，TE）成为评估肝纤维化的主要替代方法［13－16］。然而，上述无创模型主要用于肝纤维化分期的评估，而对肝组织炎症的诊断效能有限。目前，临床上缺乏同时评估肝组织炎症分级和肝纤维化分期的无创模型。因此，构建新型无创模型来预测ALT正常HBeAg阳性慢性HBV感染者是否存在显著组织学病变［炎症活动度≥G2和（或）纤维化程度≥S2］是临床研究的热点问题。

本研究旨在探讨ALT持续正常HBeAg阳性慢性HBV感染者发生显著肝组织病变的独立危险因素，并进一步基于危险因素构建一种预测肝组织学病变的无创模型，为筛选慢性HBV感染者进行肝穿刺活检或启动抗病毒治疗提供指导。

1 材料和方法

1.1 研究对象 回顾性收集了2016年5月至2020年11月在郑州大学第一附属医院就诊并行肝组织病理活检的慢性HBV感染者的临床资料。慢性HBV感染的定义为HBsAg和／或HBV DNA阳性6个月以上［3］。

入组标准：（1）HBeAg阳性；1 a内3～4次的随访ALT水平均在正常参考值范围（＜40 IU·L－1）；（2）既往未曾接受抗病毒治疗。排除标准：（1）HBeAg阴性；（2）1 a随访期ALT水平异常（＞40 IU·L－1）；（3）合并其他病毒感染如HCV、HEV或HIV感染，伴有非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝病和遗传性肝病等。最终，研究纳入了251例ALT持续正常HBeAg阳性的慢性HBV感染者。其中，2016年5月至2018年12月的156例患者构成了训练队列，2019年1月至2020年11月的95例患者构成了验证队列。本研究通过了郑州大学第一附属医院医学伦理委员会批准，所有入组患者均签署了知情同意书，研究程序符合1975年赫尔辛基宣言。

1.2 实验室指标检测

1.2.1 血常规检测 采用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司全自动血细胞分析仪BC－3000 Plus。简要流程如下：（1）用含有EDTA－K2抗凝剂的真空采血管采取静脉血2 mL；（2）混匀静脉血后，将采样针插入抗凝管；（3）选择检测界面为“全血”模式；（4）按下检测键，对样本血细胞计数。

1.2.2 肝功能检测 采用日本日立公司的全自动生化分析仪7600 Series，其中ALT的正常参考值范围为9～40 IU·L－1。简要流程如下：（1）一次性真空管采集静脉血5 mL；（2）将样品加至反应杯，使待测样品和反应试剂充分混合均匀，进行生化反应；（3）光学测量仪对反应物进行光学比色，得到检测结果。

1.2.3 HBV免疫学标志物 包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb等，采用化学发光微粒子分析技术，仪器和试剂为美国雅培公司的化学发光免疫分析仪ARCHITECT i2000SR及配套专用试剂，严格按照试剂说明书进行操作和结果判定。血清HBV DNA的提取采用中山大学达安基因股份有限公司的乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增荧光检测试剂盒，然后使用罗氏Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪进行HBV DNA定量，检测下限范围＜100 IU·mL－1。简要流程如下：（1）血清样本6 000 r·min－1离心20 s；（2）吸取上清液40μL，加入40μL DNA裂解液，充分混合均匀；（3）100℃沸水浴10 min；（4）10 000 r·min－1离心5 min，取上清液2μL用于PCR上样；（5）配制PCR扩增体系，扩增程序为93℃3 min预变性，93℃45 s，55℃45 s，72℃60 s，重复40个循环。

1.3 肝组织病理评估 在超声引导下，使用16G一次性活检针行肝组织穿刺活检，获取的肝组织经100 g·L－1的甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片，随后行HE染色、网状纤维和Masson染色。获取的肝组织长度大于15 mm，且镜下至少包含6个汇管区认为取样合格。所有肝组织切片由2位病理医生独立阅片，当阅片结果存在差异时由第3位高年资病理医生重新阅片并给出病理结果。根据Scheuer评分系统［17］，慢性HBV感染者的肝组织炎症分级为G0～4，肝组织纤维化程度分为S0～4。根据慢性乙型肝炎防治指南（2019版）［3］推荐，肝组织炎症活动度≥G2和（或）纤维化程度≥S2存在显著组织学病变，需要启动抗病毒治疗。

1.4 常用临床无创模型 临床广泛应用的评估肝组织病变的无创模型包括肝硬度测定（liver stiffness measurement，LSM）、谷草转氨酶与血小板比率指数（aspartate aminotransferase to platelet ratio index，APRI）［13］和基于4因子的纤维化指数（fibrosis4 score，FIB－4）［14］。采用FibroSacn测定肝硬度值来评估肝纤维程度。患者需在血清总胆红素＜51μmol·L－1的情况下空腹测定，连续测量10次取平均值记录为测定的肝硬度值［16］。APRI和FIB－4的计算公式如下：

式中I1为APRI，ρ1为谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平（IU·L－1），ρ’为AST正常值上限，这里为40 IU·L－1，A为血小板计数（platelets，PLT）（×109L－1），I2为FIB－4，B为年龄（岁），ρ2为ALT水平（IU·L－1）。

1.5 统计学方法 统计分析采用SPSS 25.0和Med-Calc 15.2软件。符合正态分布的连续性变量以均值±标准差（±s）表示，方差齐性的两组数据采用t检验；非正态分布的连续性变量以中位数（四分位数）［M（P25，P75）］表示，组间采用Mann－Whitney U检验；分类变量以频数和率（%）表示，组间采用Pearson χ2检验。使用单因素和多因素logistic回归分析筛选肝组织发生显著病变的独立危险因素，并应用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）、曲线下面积（area under curve，AUC）评估无创模型的预测效能。AUC数值＞0.5且＜1.0，AUC越接近1.0，提示诊断效果越好。0.5＜AUC≤0.7提示诊断价值较低，0.7＜AUC≤0.8提示诊断价值中等，0.8＜AUC≤0.9提示诊断价值较高，AUC＞0.9提示诊断价值极高。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性HBV感染者的临床参数 根据入院时间顺序，将251例初治ALT持续正常HBeAg阳性慢性HBV感染者分为训练队列（n＝156）和验证队列（n＝95）。入组患者的基线临床参数见表1。患者平均年龄为（34.1±7.8）岁，男性患者占比52.2%，HBsAg定量中位水平为4.1 log10IU·mL－1，HBeAg中位水平为2.9 log10S／CO，HBV DNA 中位水平为7.2 log10IU·mL－1。根据Scheuer评分系统，入组的251例患者中共有88例患者存在显著肝组织病变。训练队列和验证队列分别有34例（21.8%）和25例（26.3%）患者存在显著肝炎症，48例（30.8%）和30例（31.6%）患者存在显著肝纤维化，55 例（35.3%）和33例（34.7%）存在显著肝组织病变。训练队列与验证队列相比较，两组间的年龄和性别比例、白细胞计数、红细胞计数、PLT、ALT、AST、碱性磷酸酶、谷氨酰基转移酶（gamma－glutamyl transferase，GGT）、总胆红素、白蛋白、球蛋白、HBsAg、HBeAg、HBV DNA 及LSM 水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 入组慢性HBV感染者基线临床参数

2.2 慢性HBV感染者存在显著组织病变的独立预测因子 在训练队列中，入组患者根据肝组织病理结果分为非显著肝组织病变组（炎症活动度＜G2且纤维化程度＜S2）和显著肝组织病变组［炎症活动度≥G2和（或）纤维化程度≥S2］。显著肝组织学病变组与非显著肝组织病变组相比，患者的年龄、ALT、GGT和LSM更高，而患者的PLT、HBsAg、HBeAg和HBV DNA更低，差异均有统计学意义（P＜0.001）。见表2。单因素logistic回归分析表明，患者年龄、PLT、ALT、GGT、HBsAg、HBeAg、HBV DNA和LSM水平与慢性HBV感染者的肝组织病变密切相关（P＜0.05）；多因素回归分析表明，年龄、HBsAg定量和LSM是ALT持续正常HBeAg阳性慢性HBV感染者肝组织学发生显著病变的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

表2 训练队列中非显著组织学病变组与显著组织学病变组患者各指标比较

表3 ALT持续正常HBeAg阳性慢性HBV感染者发生显著组织学病变的logistic回归分析

2.3 新型无创模型的构建及预测效能比较 根据logistic回归模型，进一步构建了由年龄、HBsAg和LSM组成的预测肝组织学病变的新型无创模型：

式中X为年龄（岁），ρ为HBsAg水平（log10IU／mL），P为LSM水平（kPa）。在训练队列中，该无创模型预测显著肝组织病变的AUC为0.861，优于临床常用的无创模型，如APRI、FIB－4和LSM。同样地，在验证队列该无创模型预测显著肝组织病变的AUC为0.872，仍优于APRI、FIB－4和LSM。见表4、图2。

图1 训练队列中新型无创模型与临床常用无创模型的预测效能比较

图2 验证队列中新型无创模型与临床常用无创模型的预测效能比较

表4 新型无创模型与临床常用无创模型的预测效能比较

鉴于该新型无创模型是在LSM的基础上引入了另外2个新指标，因此，进一步应用净重新分类指数（net reclassification index，NRI）来比较新型无创模型预测能力的准确性。结果发现，不管是训练队列（NRI＝14.8%，P＝0.031）还是验证队列（NRI＝18.6%，P＝0.033），新型无创模型的预测能力均有所增强。

3 讨论

本研究显示，ALT持续正常HBeAg阳性慢性HBV感染患者中有约1／3的患者存在显著肝组织学病变。基于常用临床参数，采用logistic回归分析发现年龄、HBsAg定量和LSM是ALT持续正常HBeAg阳性慢性HBV感染者肝组织学发生显著病变的独立危险因素，并构建了由年龄、HBsAg和LSM组成的新型无创模型。该无创模型在训练队列和验证队列预测显著肝组织病变的AUC分别为0.861和0.872，均明显优于APRI、FIB－4和LSM。

在我国广泛实行乙型肝炎疫苗预防接种之前，慢性HBV感染以母婴传播为主。随着HBV感染时间延长，多数患者会打破“免疫耐受”阶段，进入到“免疫清除”阶段。李强等［18］研究发现，年龄＞30岁是ALT正常HBeAg阳性高病毒载量的慢性HBV感染者发生显著肝组织学病变的危险因素。本研究表明，对于ALT持续正常HBeAg阳性慢性HBV感染者，发生显著肝组织病变患者的中位年龄高于未发生肝组织病变患者（38岁比32岁，P＜0.001）。中国《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［3］同样指出，ALT持续正常、无肝硬化／肝癌家族史但年龄＞30岁的患者，建议行肝纤维化无创评估或肝组织学检查。因此，年龄是影响慢性HBV感染者肝组织学病变的重要因素。

HBsAg水平通常用于区分慢性HBV感染自然史的不同阶段，近年来的研究表明HBsAg在区分慢性HBV感染患者肝组织病变方面有一定价值［19］。Martinot－peignoux等［20］研究表明，HBsAg水平与初治的HBeAg阳性慢性HBV感染者肝纤维化程度密切相关。Gao等［21］研究则发现HBsAg水平是预测ALT＜2 ULN的HBeAg阳性慢性HBV感染者发生显著肝组织学病变的独立因子。目前，HBsAg用于反映肝组织学病变的机制尚不清楚，推测可能机制如下：随着HBV感染时间延长，宿主免疫功能活化进而靶向HBV在体内复制，导致了HBsAg合成减少，同时造成了肝组织损伤［19］。

LSM在评估慢性HBV感染者肝纤维化方面的价值已得到广泛证实［22－23］。欧洲肝病学会指南推荐采用LSM作为评估慢性乙型肝炎患者肝纤维化程度的无创方法［15］。我国肝纤维化诊断和治疗共识［16］指出，胆红素、ALT正常的慢性HBV 感染者LSM≥9.0 kPa考虑进展性肝纤维化，LSM＜6.0 kPa排除进展性肝纤维化，LSM在6.0～9.0 kPa之间者可考虑肝活检明确肝组织病变。Lee等［24］研究发现LSM、血清触珠蛋白、载脂蛋白A1和α2－巨球蛋白水平是预测慢性HBV感染者发生显著肝纤维化的独立因子，将LSM与血清学参数联合组成的无创模型能使近50%慢性HBV感染者免于肝穿刺活检。在本研究中，同样发现将LSM、年龄和HBsAg联合构建的新型无创模型预测显著肝组织学病变的效能要优于LSM。分析可能原因如下：本研究入组患者的ALT水平均在正常范围，虽然这在一定程度上降低了因ALT水平升高对LSM准确度的影响，但LSM还可能受到患者肋间隙宽度、肥胖程度、胆红素水平及操作者业务水平等诸多因素的影响［25］，而该新型无创模型综合评估了患者感染HBV的时间、血清学HBsAg水平及肝硬度，最大限度避免了因单一参数变异造成的预测效能下降。此外，构成该新型无创模型的3个参数在临床实践中易于获得，因此具有较高的临床应用价值。

本研究存在以下不足。第一，本研究设计属于单中心的回顾性研究，划分训练队列和验证队列主要根据患者入院时间，这种分组方式可能会造成选择偏倚。因此，该研究结论尚需要前瞻性、多中心的队列研究进行验证。第二，研究入组患者均来源于省级三甲医院，这些患者肝组织病变的检出率高于基层医疗机构就诊患者，因此，该无创模型是否适用于所有ALT正常HBeAg阳性慢性HBV感染者，仍有待进一步研究。第三，由年龄、HBsAg和LSM组成的新型无创模型的计算公式相对复杂，在后续的研究中仍需对模型进行精简完善，以期更好地服务临床。

综上所述，ALT持续正常HBeAg阳性慢性HBV感染者仍可能发生显著肝组织学病变。由年龄、HBsAg和LSM组成的新型无创模型预测显著肝组织病变的效能优于APRI、FIB－4和LSM，该无创模型对临床诊疗可能有积极作用。