大通犊牦牛心肌组织超微结构与HIF-Iα表达量早期发育变化特点的研究

胡佩莹，李莉,罗涛,杨永宁,汪生花

(1.青海农牧科技职业学院 动物医学系，西宁 812100;2.青海大学 农牧学院，西宁 810016;3.青海西宁湟中区西堡镇畜牧兽医站，湟中 810000)

“大通牦牛”是以青海昆仑山野牦牛为父本与家牦牛人工杂交的培育品种[1]，主要分布于海拔3000～4500m的青藏高原地区[2]，经过长期的人工选育和大量的试验研究，发现大通牦牛心肌组织在初生早期发育过程中从组织形态学、解剖生理学和分子生物学等方面都表现出对低氧环境适应性能力强[3]。对大通犊牦牛初生早期的低氧环境下适应性代偿改变和功能性的研究为生物的高原适应性研究奠定基础。

缺氧时，HIF-1α通过结合VEGF启动因子上的低氧应答原件，启动VEGF基因转录，从而诱导VEGF的大量表达。Yanyu He[4]等研究表明，HIF-1α、VEGF是处于高海拔地带的藏牦牛对低氧环境的生理适应和心肌发育过程中必不可少的影响因子。因此本实验采用实时定量法对从妊娠4月到出生3月的大通犊牦牛心肌组织HIF-1α表达量进行相对定量测定。与此同时，通过免疫组织化学法，从细胞形态学水平观察大通牦牛生长发育初期心肌组织中的VEGF分布，并对两者相关性进行分析研究。为探讨大通牦牛心肌组织初期发育的低氧适应机制提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1实验动物来源与处理

本试验采用青海省大通种牛场(海拔3200m)大通牦牛，在出生1日龄、1月龄、3月龄、6月龄采集心肌组织各4头份，临床健康，不计性别。

供试牛栖息地现场屠宰每头牛并在其左心室取一块1 mm×1 mm×2mm大的组织，取材时避开血管、脂肪组织。立即取材完成后，其中两头份用于固定：立即放入2.5%戊二醛溶液中4℃预固定24h，1%锇酸二次固定。另外两头份液氮速冻后置于-180℃冻存用于提取RNA测定HIF-1α mRNA表达量。

1.2主要仪器与试剂

REAL-TIME PCR扩增仪、普通PCR扩增仪(C1000 TouchTM)、紫外凝胶成像仪(Gel Doc XR+)、核酸蛋白检测仪，以上均购自BIO-RAD；Taq PCR MasterMix、RNAsimple Total RNA Kit、FastQuant cDNA，以上均购自宝生物工程(大连)有限公司； ZPJ-1A展片机、KPJ-1A 烤片机、LKB-2188(瑞典) 组织切片机、Epon812生物组织包埋冷冻台、Epon812生物组织包埋机、JEM-2000EX透射电镜(日本)。

1.3形态立体定量分析方法

1.4引物设计与合成

参考相关文献，通过NCBI查询普通牛HIF-1α 基因的mRNA序列( DQ838046.1 )，并根据其序列利用DNAstart设计合成2对荧光定量PCR的特异性上、下游引物：HIF-1αF:5’-GATAAACTTAAGAAGGAGCCTGATGCT-3’HIF-1αR:5-TGTCATTGCTGCCAAAATCTAAAG-3’，预计扩增片段191bp。上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5总RNA提取及cDNA第一链的合成。

利用 TaKaRa 公司 TRIZOL 提取总 RNA， 用紫外分光光度法测定其浓度及纯度，并用变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。参照 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 指导说明，进行 cDNA第一链合成。反转录产物用于进行实时定量 PCR 扩增反应。

1.6PCR扩增目的片段

以反转录产物为模板进行PCR扩增反应。PCR反应体系：PremixTaq酶12.5 μL，上、下游引物 0.5μL，cDNA模板 2.0 μL，ddH2O 9.5 L。PCR 扩增条件：94 ℃预变性 3 min；98 ℃变性 10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，30 个循环；72 ℃续延申10 min，充分延伸 4 ℃ 终止。PCR 产物经10 g/ L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7Real-time PCR反应

Real-time PCR扩增反应的加样体系如下：模板2μL，浓度为10μM的上、下游引物各1μL，ddH2O 8.5μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5μL。首先将反转录产物cDNA上机进行一个循环，由单链变双链，PCR扩增程序为：95℃ 5min，94℃ 15s，60℃ 10s，72℃ 2 min，39个循环；78℃ 1s，72 ℃续延申10 min，65-95 每0.05s读一次刻度。其中每三个做一次重复。

1.8数据处理

数据采用 SPSS17.0版 Duncan’s 进行多重比较 (ρ=0.05)，结果均以平均值±标准差 (`X±S )表示。

2 结果与分析

2.1大通犊牦牛心肌组织早期发育过程中定量参数变化情况如图1和表1所示大通牦牛出生后，其心肌线粒体平均截面积、平均体积和体积密度表现为先降低再升高的趋势，面数密度随年龄增长逐渐升高；除面数密度外，其余各组差异不显著。

图1 大通牦牛心肌线粒体形态结构分布(10000×)

表1 心肌细胞线粒体结构参数表

2.2目的基因片段的获得

如图2所示HIF-1α基因片段扩增结果及重组子PCR产物长度相符。

图2 大通犊牦牛心肌组织HIF-IαPCR cDNA序列扩增

2.3大通犊牦牛心肌组织中HIF-1α基因mRNA表达量

如表2显示大通犊牦牛心肌组织HIF-1α mRNA表达量出生后先降低后不断增加，六月龄又到达峰值，不同组别间差异极显著(p<0.01)。

表2 大通犊牦牛心肌组织中HIF -1αmRNA基因拷贝数

3 讨论

高海拔低氧环境下，初生动物从全身、局部和细胞各方面均产生代偿性的变化，以增加机体内氧的呼吸代谢途径便于尽快适应出生后环境的改变[5]。因此在缺氧环境下心肌线粒体会发生一系列的应激性变化。此前青海大学农牧学院李莉[6-17]等有大量研究表明：心肌线粒体对外界恶劣环境刺激以及机体自身病变应激较敏感，是细胞器中最易发生变化的细胞器。高原低氧环境下牦牛心肌线粒体结构和数量相较于平原黄牛会发生一系列的改变，故缺氧是造成心肌线粒体发生形态学变化的重要因素之一。本实验研究发现大通牦牛从出生后1日龄到6月龄早期发育过程中，心肌线粒体平均截面积、平均体积、体积密度表现为先降低再升高的趋势，面数密度随发育期的增长呈上升趋势，面数密度差异显著。体积密度和面数密度是衡量线粒体功能的重要结构参数，因此,从出生后一日龄犊牦牛为适应高原低氧环境，体密度和面密度逐渐的上升到趋于稳定的特点，与之前的大量实验结果证明相一致，由此可见，心肌线粒体结构功能的改变是高原动物早期发育过程中克服低氧环境的一个重要机制。

HIF是1992年发现的一种重要的转录因子[18,19]。当动物机体处于缺氧时和其他因子共同参与调节心肌组织血液循环供氧的能力。本实验显示犊牦牛心肌线粒体HIF-1α的表达量出生后三个月呈上升趋势。这与前期研究的大通牦牛心肌线粒体特征性基因表达量变化趋势相一致[20]。近年来研究表明[21-24]，高原动物对低氧环境的适应机制主要为：EPO升高、心肌线粒体数量增多、组织线粒体标志性酶表达升高、呼吸器官功能增强等。这些因素调节有赖于组织器官对氧分压感受对信号转导从而激活HIF-1α的表达。而本实验结果佐证了高原低氧环境下大通犊牦牛心肌线粒体通过改变HIF-1α表达量增强心血管功能，建立维持基本生命活动的一种保护机制。但到底是怎样的机制形式还需进一步研究。

综上所述大通犊牦牛心肌组织在初生早期发育过程中HIF-1α不断诱导VEGF大量表达。由此表明大通犊牦牛心肌组织低氧耐受性与HIF-1α对VEGF的调控息息相关，但具体的调控机制还亟需进一步研究。