一株青海天峻县牦牛源致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

完马单智，简莹娜，王贵元，张学勇，扎西东主，王光华，才旦卓玛，王戈平，林伟山，李秀萍，马利青

(1.青海省海西州天峻县木里镇畜牧兽医站,天峻 817299；2.青海大学畜牧兽医科学院,西宁 810016)

牦犊牛腹泻为牦牛常见疾病，主要病原有致病性大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌、球虫、隐孢子虫、贾第鞭毛虫、牛病毒性腹泻病毒、轮状病毒及冠状病毒等[1]。目前，虽然临床上治疗牛腹泻的药物很多，但是多数情况下由于不能够清楚地分离鉴定到致病原，仅简单采用抗生素类药物治疗，有时不能做到有效治疗，甚至出现耐药性菌株。

大肠杆菌为条件性致病菌，当环境骤变引起家畜较强的应激反应、抵抗力免疫力降低时，非常容易诱发牛羊等家畜大肠杆菌病，但以犊牛、羔羊更为易感，发病急、病死率高，多呈地方性流行[2，3]。大肠杆菌的耐药机理复杂，主要有产生质粒型广谱和超广谱的β 内酰胺酶水解β内酰胺类抗生素，产生耐药甚至多重耐药[4]。最新研究报道称耐药基因可以通过质粒垂直传给下一代，并且水平传播至人和其他动物[5-7]。为了避免出现耐药菌株，希望有关兽医相关部门对动物疾病严格诊断、进行耐药性分析，根据试验结果指导临床用药。

本研究通过对木里镇死亡牦犊牛组织样品进行细菌分离培养和PCR分子鉴定，确诊引起牦牛腹泻乃至死亡的致病原，对致病原进行致病性及耐药性研究，以期为该地区有效防治牦牛腹泻提供科学参考依据。

1 材料与方法

1.1病料采集

在青海省天峻县木里镇某牦牛牧场，按照采样要求，对因腹泻致死的牦犊牛进行组织样品(心、肝、脾、肺、肾及肠道内容物)采集，各1份，将样品保存于冰盒及时送检至实验室进行分析。

1.2主要试剂仪器

本次试验所用实验试剂如下: 2×Easy Taq PCR SuperMix、Trans 2K DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物合成及测序均由苏州金唯智生物科技有限公司完成；鲜血营养琼脂为本实验室配置；其他均为国产常规试剂。本次试验所用的主要仪器包括恒温培养箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、离心机、微量移液器、干式孵育器等。

1.3试验动物

昆明系小鼠6 只，雌雄各半，6～8 周龄，体重16～20 g，购自兰州兽医研究所实验动物中心。

1.4细菌分离培养

将各组织进行无菌分离培养至鲜血营养琼脂、厌气肉肝汤以及营养肉汤培养基中，置于37℃恒温培养箱24 h后进行观察，有无溶血，细菌形态。

1.5致病性实验

将脾脏中1株溶血菌株进行纯化，取0.2 mL18 h培养物，经腹腔注射给实验小白鼠，于24 h内死亡。

1.6PCR鉴定

提取分离菌株的基因组DNA，进行PCR扩增鉴定。按照参考文献[8]中细菌16S rRNA 引物序列合成引物，序列信息为16S-F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCT CAG-3'，16S-R: 5'- TCAGGTTACCTTGTTACGACT-3'。25 μL 反应体系: 2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，纯化水7.5 μL，DNA 模板3 μL。反应程序: 95 ℃预变性5 min；95 ℃变性35 s，60℃退火35 s，72℃延伸2 min，35 个循环；72 ℃再延伸10 min。将扩增后的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，利用凝胶成像仪观察拍照，并PCR产物纯化，送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。

1.7药敏试验

参照美国临床和实验室标准协会标准(CLSIM100)，采用K-B 纸片扩散法进行药敏试验[9]，将菌悬液均匀涂布于MH培养基上，用无菌镊子放置抗生素药敏片，37℃孵育24 h，测定抑菌圈直径，根据有无抑菌圈及抑菌圈直径大小判断分离菌对各种药物的敏感程度。

2 结果

2.1细菌分离结果

从病死牦犊牛脾脏中分离到1株具有β溶血，灰色，中等大小，圆形隆起的菌落。

2.2PCR鉴定

以分离株基因组DNA为模板，以16S rRNA基因片段的引物进行PCR扩增，获得了预期的基因片段，其大小约1500 bp，见图1。通过测序获得序列信息，利用在线BLAST 软件工具对序列进行同源性比对。结果表明分离菌株与大肠杆菌(Genebank登录号为MZ209199.1)序列同源性为99%，鉴定该菌为大肠杆菌。

图1 细菌16S rRNA扩增结果图

2.3致病性实验

试验组小鼠均于24h内死亡，对照组小鼠无异常。将试验组小鼠剖检，小鼠肠鼓气，将小鼠肝脏进行分离培养，小鼠肝脏分离菌落形态与上述牦牛脾脏分离菌株形态一致，具有β溶血，灰色，中等大小，圆形隆起的菌落，经革兰氏染色后形态与牦牛脾脏分离菌株一致，为革兰氏阴性短杆菌，说明该菌株具有致病性。

2.4药敏试验

分离菌株对庆大霉素、诺氟沙星、左氧氟沙星及氧氟沙星药物敏感；对多黏菌素E 和阿米卡星等药物中敏；对多黏菌素B、氯霉素等药物耐药。

表1 分离菌株的药敏试验结果

3 讨论

对送检牦犊牛病料进行细菌分离，于脾脏中分离到1 株致病菌，经过动物致死试验、PCR分子生物学鉴定结果判定该分离菌株为致病性大肠杆菌。表明本次引起该牧场牦犊牛死亡的主要病原菌为大肠杆菌。根据药物敏感性试验结果，建议使用庆大霉素、诺氟沙星等敏感药物对其他患病牦犊牛进行治疗，从而达到较好的效果，控制该疾病的扩散、蔓延。

抗生素的不合理使用日趋严重，成为一个全球性问题，其耐药范围、种类并且多重耐药性呈上升趋势[10]。为保证畜牧业发展和人类健康，建议不要盲目使用抗生素。本试验分离到的大肠杆菌对多黏菌素E、氯霉素、红霉素、强力霉素及四环素等药物耐药，提示以上药物不适合使用。此外，在养殖过程中还应加强环境消毒，降低动物的应激反应，加强家畜的饲养管理，提高家畜自身的免疫力，及时隔离病畜预防疾病的大规模扩散，结合本地区情况制订合理的治疗程序，在选择药物之前先做药敏试验，筛选敏感药物进行治疗，这样既能达到较好的治疗效果，又能降低成本，还能减少耐药菌株的产生。