药用淫羊藿开花结实及种子休眠特性研究进展△

闫滨滨，崔欣萍，万修福，康传志，王升，孙嘉惠，杨健，张燕

中国中医科学院 中药资源中心 道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700

淫羊藿又名仙灵脾、刚前，是小檗科淫羊藿属植物的干燥叶，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效[1]340。现代研究表明，淫羊藿属植物含有淫羊藿素、淫羊藿苷、去甲基淫羊藿苷、黄酮类、生物碱等成分[2-3]，可用于降血糖、降血压、镇咳祛痰平喘、杀菌抗炎、抗骨质疏松、抗肿瘤、抗抑郁、抗衰老、提高性机能等[4-12]。随着我国现代中药产业化的迅速崛起，国内和国际市场对淫羊藿需求量越来越大，而市场上流通的淫羊藿药材大部分来自野生资源且为全株挖取。随着野生药材的大量采挖，淫羊藿野生资源逐年减少[13-15]，资源和生态破坏较大。因此，积极开展淫羊藿人工栽培不仅能取得更好的经济效益，还对生态恢复有一定促进作用。自然条件下的淫羊藿有性生殖能力较弱，开花率和结实率都不超过10%[16-17]。杨利民等[18]研究发现，朝鲜淫羊藿平均开花率不超过8%，结果率不超过6%，因此，淫羊藿维持种群更新和生长的主要方式为无性繁殖[19]。淫羊藿种子有明显的休眠现象，自然条件下约1 年才能出苗[17]。另外，淫羊藿属植物主要生长在阴冷潮湿的山沟中，生境比较特殊，果实成熟后容易自裂，很难准确把握种子采收时间[20]。

虽然淫羊藿种子繁殖较为困难，但种子作为繁殖体，能够选育出优势种质，遗传性状十分稳定，有利于种源保护，容易实现扩大繁殖。因此，应进一步加强研究，使其能满足淫羊藿实际生产需求和品种保护。张著林等[21]对粗毛淫羊藿种子的繁殖研究结果显示，其出苗率最低为17%，最高为55%，由此可见，使用种子繁殖具有一定的可行性。综上所述，为使药用淫羊藿植物资源得到可持续利用，针对淫羊藿开花结实及种子休眠特性开展研究非常重要。

1 淫羊藿的种质资源

淫羊藿是小檗科淫羊藿属植物的统称，全世界约有68 种，分布于欧洲意大利北部至黑海，非洲北部，亚洲西喜马拉雅地区、中国、朝鲜和日本。我国作为该属的现代地理分布中心，约有40 种，分布于四川、重庆、贵州、湖北、陕西、湖南、甘肃及东北各省。其中，四川是主要分布区，主产地有雅安、乐山、峨眉山、甘孜、阿坝、宜宾、眉山、成都等[20]。但不是所有淫羊藿都可作为药用[22]。目前，作为药用的淫羊藿有十几种[23]，《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版收载的有5 种，分别为淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、柔毛淫羊藿E.pubescensMaxim.、箭叶淫羊藿E.sagittatumMaxim.、朝鲜淫羊藿E.koreanumNakai、巫山淫羊藿E.wushanenseT.S.Ying[1]340。除此之外，粗毛淫羊藿E.acuminutumFranch.、天平山淫羊藿E.myrianthumStearn、毡毛淫羊藿E.coactumH.R.Liang&W.M.Yan、黔岭淫羊藿E.leptorrhizumStearn 为贵州省地方标准收载种[24-29]。

《中国药典》2020 年版收载的5 种淫羊藿主要分布区域情况为淫羊藿和柔毛淫羊藿适宜生境面积最大的地区为四川省，这2 种基原在分布范围上也存在重合，主要集中于甘肃、陕西和四川省的低海拔林区[23]；朝鲜淫羊藿作为特有种，仅分布在与朝鲜接壤的辽宁和吉林部分地区；箭叶淫羊藿主要集中于浙江和安徽交界一带；巫山淫羊藿分布区域较广，集中于川东、渝北、陕南区域和贵州东南部，少量分布于湖北西部和广西北部[24]。

2 药用淫羊藿的开花结实特性

2.1 淫羊藿的开花物候

开花物候是描述植物生活史及其特征的重要表征方式[30-32]，植物个体生殖成功与否、植株间生长、种群动态等各方面都受植株个体开花物候影响。淫羊藿开花周期为1年1次，早春开花，花期主要集中在2—4 月，因种类和生境条件不同，其开花期有所差异（表1）[33-34]。同一种类不同地点的淫羊藿开花期不同。例如，四川南充地区的柔毛淫羊藿开花期为3月上旬至4月上旬，而四川雅安地区的柔毛淫羊藿开花期较长，为2月下旬至4月下旬；四川南充地区的箭叶淫羊藿开花期为2月上旬至3月下旬，而河南驻马店地区的箭叶淫羊藿开花期为3月下旬至4月下旬。相同地点不同种类的淫羊藿开花期有所差异。例如，四川雅安市的绿药淫羊藿开花期为2 月下旬至4 月下旬，兴宝淫羊藿为3 月上旬至3 月下旬，天全淫羊藿的开花期为2月下旬至3月下旬。其开花天数也有所不同。相同地点不同种类的淫羊藿结实期不同，如四川雅安市的绿药淫羊藿结实期为3 月上旬至4 月下旬，兴宝淫羊藿为3 月中旬至3 月下旬，而天全淫羊藿却为2月下旬至4月中旬。其结实期天数也有所差异。

2.2 淫羊藿植株开花结实特点

淫羊藿属植物的单株开花数和结实数因种类和生境不同而不同（表2）[33-34]。同种淫羊藿在不同生境下单株开花数不同，如柔毛淫羊藿在唐家河自然保护区、金城山自然保护区、四川农业大学的单株开花数差异较大，最少为18朵，最多为51朵。相同生境下不同种类淫羊藿的单株开花数也不同，如四川雅安市（四川农业大学）的柔毛淫羊藿、绿药淫羊藿、宝兴淫羊藿、天全淫羊藿的单株开花数均不同。不同种类淫羊藿的单株结实数差异较大，如柔毛淫羊藿、绿药淫羊藿、宝兴淫羊藿、天全淫羊藿单株结实数差异较大，最少为2个，最多为81个。

淫羊藿花果期可分为始花期、盛花期、末花期和结实期4个时期。始花期指第一朵花开花的日期，盛花期指80%花序开花的日期，末花期指最后一朵花凋零的日期，结实期指果实50%以上籽粒坚硬日期[20]。研究表明，坐果数与盛花期、花期持续时间均呈极显著正相关，但与始花期无相关关系[33]。谭淋等[35]调查发现，开花期越早，植株结实率越高、种子越饱满。单株花序的开花顺序为花序基部各分支中间花蕾-花序基部两边花蕾和花序中部各支的中间花蕾-花序中部各支两边花蕾-花序上部花蕾。淫羊藿单花开花动态一般是花蕾长至一定花长，外萼片开始脱离，花瓣完全开放后开始授粉，授粉成功后，雄蕊与花距脱落，之后花瓣脱落，最终剩下果实[34]。

3 影响药用淫羊藿开花结实因素

3.1 开花的时空效应对淫羊藿结实的影响

淫羊藿开花结实的影响因素较多，开花时期（时间效应）、花序生长部位（位置效应）、环境条件、授粉方式、花粉活力、花型等，都对淫羊藿开花率、结实率、种子千粒质量有显著影响。如表3所示，在开花时间效应对淫羊藿的影响中，早期和中期的开花率、结实率、种子千粒质量要显著高于晚期。种子败育率在晚期较高，而在早期和中期较低[36]。开花时间效应对内萼片长、内萼片宽、花药长、花距宽、花距长的影响显著，其参数均是早期和中期大于晚期[37]。开花的位置效应对巫山淫羊藿的生殖成功具有显著影响，其基部和中部的种子败育率均显著低于顶部，种子数量、千粒质量均显著高于顶部[37]。

3.2 环境因素对淫羊藿开花结实的影响

光照强度、温度、水分、极端天气（大风、大雨）等环境因素对淫羊藿开花结实具有显著影响。如表3 所示，光照强度对开花结实的影响较明显。研究表明，在光照强度较低的生长环境下（高大乔木松树林下，土壤被松针覆盖，小草本植株稀疏分布，郁闭度高达80%），朝鲜淫羊藿结实率最高。在光照强度适中的生长环境下（四面有灌木环绕，朝鲜淫羊藿生长地方主要分布一些草本植物，郁闭度50%），单株平均开花数最多且种子千粒质量最大[38]。水分对花的形成过程十分必要，如果水分不足，会让幼穗形成延迟。四川南充市在3—4 月雨水充足，相对湿度保持在70%～94%，这是箭叶淫羊藿生长的重要条件。温度对开花也有重要影响，在箭叶淫羊藿开花时期，温度保持在10～13 ℃[39]。极端天气对开花结实的影响较大，研究表明，低温阴天单花寿命较长；大雨天气则单花寿命大大缩短。柔毛淫羊藿的花极容易败育，特别是在遇到大风雨天气，不仅花蕾和花朵易被打落或凋谢，同时造成传粉的昆虫无法帮助授粉（淫羊藿主要属虫媒花），淫羊藿的结实率必然很低[40]。

表3 药用淫羊藿开花结实影响因素

3.3 花型对淫羊藿结实的影响

巫山淫羊藿的结实特性受到生境和花部特征的双重影响，其中花型比生境对巫山淫羊藿结实特性影响更为明显[41]。巫山淫羊藿具有3种花部特征，即雌蕊长度等于或者短于雄蕊（PESS）、雌蕊长于雄蕊（PLS）、雌蕊长于雄蕊并发生偏离雄蕊的弯曲生长（SAA）的花部特征。不同花部特征的果实饱满种子数、败育数和败育率差异均有统计学意义（P＜0.05），而种子数差异不大。其中，花部特征PESS的饱满种子数显著低于其余2 种花部特征，而花部特征PESS败育数和败育率要显著高于PLS和SAA。

4 药用淫羊藿的传粉特性

淫羊藿主要为异花授粉，属于虫媒花，其柱头可授性及花粉活力均与开花时间有一定的相关性[36,42]。对朝鲜淫羊藿授粉相关研究表明，去雄、自花授粉结实率低，且结出的种子干瘪；去雄、异株授粉，不套袋结实率高达90%，单果种子数也最多，且种子较大而饱满[42]。巫山淫羊藿自然传粉的结实率也显著低于人工异花授粉[36]，说明其采用自花授粉方式不利于结实。淫羊藿主要传粉者为蜜蜂，传粉者主要诱物为产生花蜜的花距，缺失花距会影响传粉者访问，显著影响巫山淫羊藿的生殖成功[36]。

朝鲜淫羊藿不同开花状态下，柱头可授性差异较大，在中蕾时柱头开始具有可授性，随着花蕾增大，柱头可授性逐渐增强，至花瓣刚刚张开，花粉散出时最强，然后下降。小蕾时花粉活力最高，其次为盛花期，末花期最低。推测花粉活力的影响因素主要是温度[43-46]，研究表明，在24 h内乌丹蒿传粉效率与气温呈正相关[47]。推测淫羊藿的异花授粉特性是植物自身为了降低气温变化对传粉的影响而作出的相应反应[48]。

5 药用淫羊藿种子休眠特性

5.1 药用淫羊藿种子休眠原因

淫羊藿种子有明显的休眠现象，休眠原因主要为胚形态后熟与发芽抑制物。如表4 所示，对巫山淫羊藿研究表明，其种皮没有明显吸水障碍，通过解剖观察发现，其自然成熟时种胚尚未完全发育成熟，同时发现其种皮与胚乳提取物可明显抑制白菜幼根的生长，说明种子休眠的主要原因为胚形态后熟及发芽抑制物[49]。对朝鲜淫羊藿研究表明，其种子同样存在明显的形态后熟现象，种皮透水性好，无机械障碍，种子中含有一定活性的萌发抑制物质[50]。拟巫山淫羊藿[51]与箭叶淫羊藿[52]种子也存在胚形态后熟及发芽抑制物导致种子休眠的现象。

表4 药用淫羊藿种子休眠原因及打破休眠方法

5.2 药用淫羊藿种子的破眠方法

层积或使用生长调节剂处理可打破淫羊藿种子休眠，但不同品种的淫羊藿种子破眠方法并不一致[51]。研究表明，低温层积较其他方法可显著促进巫山淫羊藿种胚形态发育，发芽率可由0 提高至79.3%[49]。而朝鲜淫羊藿需要先经过暖温砂藏促进胚的发育，再经过低温层积加速胚的发育[50]。拟巫山淫羊藿种子与朝鲜淫羊藿相似，同样需要先暖温砂藏再低温层积，发芽率可由6.99%提高至90%[51]。层积有利于打破种子休眠，推测是由于层积促使种胚新陈代谢，增加酶活性，有利于种子内大分子营养物质（脂肪、蛋白质等）分解为小分子营养物质，供给种胚生长发育，从而打破休眠[49]。

除了层积处理外，不同生长调节剂处理，对种子萌发也有一定的促进作用。脱落酸（ABA）和GA 为2 种相互拮抗的植物激素，在种子休眠与萌发中起着重要的调控作用。ABA 为种子萌发抑制因子[53-55]，GA为种子萌发促进因子[56-59]，内源ABA/GA水平决定着种子对环境信号的响应特性，进而使种子表现出休眠或萌发的现象[60-61]。氟啶酮为ABA 生物合成抑制剂，具有促进种子萌发的作用[62-63]。单纯的试剂处理可能对种子有一定伤害，如GA 具有增加烂种率的风险，因此不同生长调节剂配合使用可能对种子解除休眠效果更好。研究表明，10 mg·L-1氟啶酮+300 mg·L-1GA 处理可有效打破巫山淫羊藿种子休眠[49]。生长调节剂与层积处理协同使用，效果也较佳，100 mg·L-1GA 浸泡6 h 后低温4 ℃层积可有效打破拟巫山淫羊藿种子休眠[51]。各淫羊藿种子具体打破休眠的方法见表4。

6 展望

随着我国现代中药产业化的迅速崛起，国内和国际市场对药用淫羊藿的需求量越来越大[13]。但淫羊藿自然授粉率低、种子败育率较高、种子形态参数较差、种子休眠现象严重。因此，针对提高淫羊藿结实率、快速打破种子休眠，提高种子发芽率的研究势在必行。根据目前对淫羊藿开花结实的研究现状，建议今后从以下方面开展研究：1）加强药用淫羊藿开花结实影响因素的调查研究。目前，研究主要针对淫羊藿开花结实的生物学特性，对影响其开花结实的环境因子还没有系统地开展，需要从光照、水分、土壤条件、营养条件等多方面进行探索，为提高淫羊藿开花结实率研究奠定基础。2）种子丰产栽培技术研究。淫羊藿种子产量低，开花结实率不稳定，造成该现象的原因可能是营养不足、花粉活力降低[64]、高温[65]等。其还与整个栽培生产过程有关，需要进一步从种植模式、种植密度[66-68]、授粉技术[69-71]、灌溉[72]、施肥[73-76]、采收期等多方面开展系列研究，以提高其种子产量和质量，最终制定科学的淫羊藿良种繁育技术规程。3）快速高效打破种子休眠技术研究。目前，已经明确淫羊藿种子休眠是由于形态后熟与发芽抑制物，但尚未建立高效破除种子休眠的技术。可以从层积基质[77]、层积温度[78]、层积时间、不同调节剂配合处理[57]、调节剂与层积协同使用等方面着手，建立一套成熟的打破种子休眠的技术，同时开展其休眠机制研究。4）良种选育。分别从开花时间、植株性状、结实率等方面筛选开花结实时间一致、环境适应能力强、结实率高、产量质量均较高的种质类型。从种源上解决淫羊藿出苗率与结实率低、种子采收困难等问题。