不同浓度乙醇溶液对黑骨藤提取物的影响

孙文娟 龙毅

摘要：通过比较不同黑骨藤提取物对淋巴细胞增殖抑制作用的影响，确定其提取物制备的最佳方法及有效成分的预测。采取不同比例水—醇混合物提取的方式，获得6种不同的黑骨藤提取物，将这些提取物进行淋巴细胞增殖抑制试验，确定最佳提取方法。检测各提取物中杠柳苷系列化合物含量，以了解该指标是否与黑骨藤免疫抑制活性存在关系，明确杠柳苷系列化合物对黑骨藤免疫抑制活性的影响。结果表明，极性较小的提取体系更有利于获得免疫抑制能力强的黑骨藤提取物，同时黑骨藤提取物的免疫抑制能力与其杠柳苷系列化合物的含量正相关。杠柳苷系列化合物很可能是黑骨藤的免疫抑制有效成分，有必要进一步研究其作为黑骨藤质量鉴定指标的可能性。

关键词：黑骨藤;提取;有效成分;杠柳苷

中图分类号：R284.2

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2022）02-0088-005

国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.02.014

黑骨藤是萝藦科杠柳属植物西南杠柳Periploca forrestii Schltr.的干燥根或全株，主要分布于我国西南地区[1]，是苗族常用药材，收载于《中华本草苗药卷》[2]。黑骨藤具有通经活络、活血和祛风除湿等功效，常用于治疗风湿、类风湿、骨折、闭经等病症[3-4]。研究发现其具有抗炎、抗风湿、镇痛、强心及抗肿瘤等药理活性[5-10]。民间多以煎煮或酒制的方式入药，但何种炮制方法最为有效并未明确。黑骨藤的研究众多，但其药效物质基础仍未明确。在众多黑骨藤有效成分的相关研究工作中，Feng等[11]的一项研究引人注目。在这项研究中，四种孕甾糖苷从黑骨藤乙醇提取物中分离出来。后续的细胞试验证明了这些孕甾糖苷对T淋巴细胞的增殖有抑制作用。事实上，这并非天然孕甾糖苷化合物的免疫抑制作用被首次证实。早在1987年，日本化学家便首次从杠柳中分离鉴定出了一类孕甾糖苷化合物——杠柳苷[12]，随后的体内外试验就证明了这类化合物具有显著的免疫抑制活性[13]，佐证了该中药风湿症的治疗功效。之后，很多天然药物研究者都将这类糖苷作为研究重点。黑骨藤中同样含有杠柳苷[14]，黑骨藤与杠柳同为杠柳属植物，且同为治疗风湿免疫疾病的植物药，杠柳苷是杠柳的有效活性成分，，很可能也是黑骨藤中的重要的免疫抑制成分。

本研究计划采取不同比例水醇混合物提取的方式，获得黑骨藤提取物，将这些提取物进行淋巴细胞增殖抑制试验，确定最佳提取方法。其后，检测各提取物中杠柳苷系列化合物含量，以了解该指标是否与黑骨藤免疫抑制活性存在关系，明确杠柳苷系列化合物对黑骨藤免疫抑制活性的影响。查阅相关文献发现，黑骨藤中含有多种以杠柳苷元为母核的杠柳苷类化合物（如杠柳苷、periplogenin 3-O-β-D-dig、periplogenin 3-O-β-D-cym和periplogenin 3-O-β-D-glul（ 1→4）-O-β-D-dig）[15]，它们的主要区别在配糖位置上，为了全面了解这类杠柳苷系列化合物对黑骨藤免疫抑制作用的影响，本试验计划采用酸水解反应使黑骨藤提取物中的糖苷水解，通过测定水解产物中杠柳苷元的含量，推测出杠柳苷系列化合物的总含量。现有的相关研究大多是以杠柳苷单独作为检测指标[14]，目前未见同时检测黑骨藤中具有相同母核结构的杠柳苷类化合物的方法。本研究计划建立同时检测黑骨藤中以杠柳苷元为母核的杠柳苷类化合物总含量的方法，以期为建立黑骨藤的质量控制标准提供新的理论依据，为后期临床应用提供可靠的试验参考依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器

EX225DZH电子天平，准确度等级I，奥豪斯仪器（常州）有限公司;高效液相色谱仪，型号Waters2690，美国Waters公司;医用离心机，型号TDZ4-WS，湖南平凡科技有限公司;二氧化碳培养箱，型号3111，赛默飞世尔科技有限公司;FACS CantoII流式细胞仪，美国BD公司。

1.1.2试剂

杠柳苷元，成都普思特生物科技股份有限公司，质量分数99.90%，批号PS010060;水为二次蒸馏水（自制）;磷酸缓冲盐溶液（PBS），BI公司，批号2014012;RPMI 1640培养基，Gibco公司，批号8120279;胎牛血清（FBS），BI公司，批号2033119;CFSE，BD公司，批号9326177;二甲亚砜（DMSO），索莱宝公司。乙醇为分析纯，乙腈、甲醇均为色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.1.3药材

黑骨藤购自贵阳太升中药材名品特产市场，经贵州中医药大学生药学实验室杨烨博士鉴定为萝摩科植物西南杠柳Periploca forrestii Schltr.的全株切片。

1.1.4细胞株

人T淋巴细胞系H9，HTB-176，源自美国ATCC细胞库。

1.2各黑骨藤提取物的制备

取黑骨藤药材约250 g，粉碎，过80目药典筛得药材粉末。准确称取黑骨藤粉末6份，每份25 g，置于500 mL燒杯中，分别加入水和5%、20%、40%、60%、75%的乙醇溶液450 mL，60 ℃超声30 min提取2次，合并提取液。分别将6个不同比例提取液过滤后平均分成2份，一份用于水解，55 ℃浓缩至无醇;另一份提取液55 ℃浓缩成浸膏，留样用于细胞试验。

1.3HPLC检测样本制备

由于植物中的杠柳苷衍生物较多，主要区别在配糖位置上。为了完整了解以杠柳苷元为母核的杠柳苷类化合物对黑骨藤免疫抑制作用的影响，通过水解反应将黑骨藤提取物中的糖苷水解，检测水解液中的杠柳苷元含量。水解方法如下：分别将提取液浓缩至无醇，加入适量水定容至200 mL，然后用盐酸调节pH=2，60 ℃水解3 h。水解完全后，分别用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，50 ℃浓缩成浸膏。将萃取浓缩浸膏共6份，分别用80%甲醇超声溶解，定容至50 mL，取样2 mL用于液相检测。以杠柳苷元为对照，测量各水解馏分中指标成分的含量。

1.4细胞试验样本制备

将黑骨藤6份提取液浓缩浸膏用50%的DMSO水溶液溶解为1 mg/mL的样本待测。

1.5人T淋巴细胞系H9培养及CFSE检测

1.5.1细胞培养

人T淋巴细胞系H9培养液为含10% FBS的RPMI-1640，培养条件为37 ℃、5% CO2。

1.5.2CFSE溶液配制

将500 μg CFSE溶解于180 μL DMSO中，即得5 mmol/L的储存液，于-20 ℃避光保存。使用时，用无血清RPMI-1640培养液稀释成5 μmol/L的工作液备用。

1.5.3CFSE染色及给药

将培养瓶中的人T淋巴细胞系H9于1000 r/min离心10 min，用 PBS重悬洗涤2次，计数，调整细胞浓度为1×107个/mL。取1 mL上述细胞悬液中加入CFSE（终浓度为5 μmol/L ），37 ℃避光孵育8 min后，加入2 mL预冷的含40% FBS的PBS终止染色，1000 r/min离心5 min，用不含FBS的PBS洗涤2次。用含10% FBS的RPMI1640培养基重悬，计数，将细胞调整为1×106个/mL，加入6孔板，每孔1 mL细胞悬液，50 μL样本，终体积为2 mL。试验样本分组如下：阴性对照组、水提取物组、5%、20%、40%、60%、75%乙醇提取物组。在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育60 h后，收集细胞，用预冷PBS将细胞洗涤2次，再用1 mL PBS重悬细胞，采用流式细胞仪于FL1通道检测，判断各样本对人T淋巴细胞系H9增殖的影响。

1.6各水乙醇混合体系黑骨藤提取物杠柳苷含量检测

1.6.1色谱条件

流动相：乙腈-5%聚酰胺（27∶73）;检测波长：220 nm;流速：1.0 mL/min;柱温：35 ℃;进样量：5 μL。色谱柱为Diamonsil C18色谱柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μmol/L）。

1.6.2对照品溶液的制备

精密称取杠柳苷元对照品3.6 mg置于10 mL容量瓶中，加入80%甲醇超声溶解，稀释并定容为0.36 mg/mL的对照品溶液。

1.6.3供试品溶液的制备

制备方法见1.2。

2结果与分析

2.1各黑骨藤提取物淋巴细胞增殖抑制试验

各黑骨藤提取物与H9淋巴细胞共孵育后，CFSE染色后流式细胞术检测结果见图1、图2。

由上述结果可以发现，极性较小体系更有利于获得免疫抑制能力强的黑骨藤提取物。水提物虽

然可以明显抑制免疫细胞增殖，将总增殖细胞比例从94.2%降至71.1%，但在提取体系加入少许乙醇（5%）后，抑制效果更加明显，第三代细胞的比例与水提取物相比降低了10.3%。当提取体系中的乙醇含量继续增加到20%至40%后，第三代细胞的增殖几乎完全被抑制，总增殖细胞降低到了40%左右。但继续提高提取体系中的乙醇含量并不能显著促进黑骨藤提取物的免疫抑制作用。

2.2各水—乙醇混合体系黑骨藤提取物杠柳苷系列化合物含量

由前述研究可知，水—乙醇混合提取体系有利于获得免疫抑制能力强的黑骨藤提取物。但这些提取物之间仍然存在免疫抑制能力差距，为了了解这些提取物的免疫抑制作用是否与杠柳苷系列化合物含量存在联系，本试验使用HPLC方法检测了各水—乙醇混合体系黑骨藤提取物酸水解后产物的杠柳苷元的含量（图3和表1）。

从以上结果可以发现，当提取体系中加入乙醇后，混合体系制备的提取物的酸水解产物中杠柳苷元含量更高，且该系列糖苷含量与提取体系中乙醇含量正相关。但当提取体系中的乙醇含量上升至40%后，继续提高乙醇含量对黑骨藤提取物的酸水解产物中杠柳苷元含量的促进作用并不明显。这一变化趋势与这些提取物的免疫抑制能力趋势基本相同。

3结论与讨论

随着对黑骨藤化学成分不断深入的研究，大量化合物被分离出来，其中甾体类化合物的种类较多，主要分为强心苷类、植物甾醇和C-21甾类[15-18]。之前部分研究者对香加皮中强心苷类化合物杠柳苷的药理作用进行了研究，发现其具有免疫抑制、强心和抗肿瘤等作用[19-22]，但对黑骨藤中杠柳苷的药理作用研究鲜有报道。由于黑骨藤中与杠柳苷具有相同母核结构的糖苷种类较多[15]，因此，为了了解这一类化合物在黑骨藤中的药理作用，本试验对不同黑骨藤提取物中这一类糖苷免疫抑制作用进行了整体的研究。

本研究发现，黑骨藤提取物中杠柳苷系列化合物含量与其免疫抑制活性正相关。而提取物中该系列糖苷含量又与提取体系的极性有关，降低该极性有利于提高黑骨藤提取物中杠柳苷系列化合物的含量。这可能是因為杠柳苷类化合物的苷元部分极性较低造成。但提取体系降低到一定程度后，继续降低极性并不能进一步提高上述糖苷含量。这可能是因为糖苷分子中还具有极性较大的配糖结构，这使得整个分子的极性折中，导致这类化合物在极性过低的溶剂中的溶解性并不好。因此，乙醇有利于提高黑骨藤的炮制效果，但乙醇的浓度含量到达40%左右后，上述杠柳苷类化合物含量已达峰值，故选择浓度40%左右的乙醇溶液提取黑骨藤效果最佳。

本研究还发现，黑骨藤提取物对免疫细胞的增殖抑制主要发生在第三代细胞上，这可能是因为黑骨藤的治疗通路较长。因此，临床治疗中，该药物的治疗周期可能较长。

本研究证实了极性较小的提取体系更有利于获得免疫抑制能力强的黑骨藤提取物，同时黑骨藤提取物的免疫抑制能力与其杠柳苷系列化合物的含量正相关。杠柳苷系列化合物很可能是黑骨藤的免疫抑制有效成分，有必要进一步研究其作为黑骨藤质量鉴定指标的可能性。

参考文献：

[1]汪毅.中国苗族药物彩色图集[M].贵阳：贵州科技出版社，2002：665-667.

[2]邱德文，杜江.中华本草（苗药卷）[M].贵阳：贵州科技出版社，2005：526-527.

[3]梁江，马武开，刘正奇，等.黑骨藤乙醇提取物影响人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖及COX-2、PGE-2表达的研究[J].时珍国医国药，2015（1）：24-27.

[4]乔杨.黑骨藤追风活络微丸处方及制备工艺的研究[J].山地农业生物学报，2016，35（4）：5.

[5]刘明，刘刚，刘育辰，等.黑骨藤镇痛抗炎作用活性部位筛选[J].药物评价研究，2014，37（4）：322-325.

[6]李慧敏，赵喜玲，李小云，等.黑骨藤抗类风湿性关节炎的有效成分研究[J].中药材，2016（3）：649-651.

[7]鲍春梅，孙广臣.黑骨藤皂苷对特应性皮炎小鼠的治疗作用及对Th1型免疫反应的影响[J].山东医药，2017，57（13）：32-35.

[8]杨婉珠，刘育辰，杨虹，等.苗药黑骨藤醇提物乙酸乙酯部位对离体蛙心功能的影响[J].中国药房，2019，30（19）：2650-2655.

[9]张鹰，赵芡，李轩豪，等.基于网络药理学的苗药黑骨藤防治肺癌分子机制研究[J].中药材，2019，42（2）：399-404.

[10]王恒，吉杨丹，王燕林，等.黑骨藤对坐骨神经损伤大鼠的保护作用[J].重庆医学，2019，48（9）：55-58，65.

[11]Feng J Q，Zhang R J，Zhou Y，et al.Immunosuppressive pregnane glycosides from periploca sepium and Periploca forrestii[J].Phytochem，2008，69（15）：2716-2723.

[12]Hikino H，Oshima Y，Hirota T.Periplosides A，B and C，steroidal glycosidesof periploca sepium root-barks[J].Heterocycl，1987，26（8）：2093-2098.

[13]Wang L Y，Chen Z H，Yu Z，et al.Structural revision of periplocosides and periperoxides，natural immunosuppressive agents from the genus Periploca[J].Phytochem，2011，72（17）：2230-2236.

[14]劉育辰，刘刚，张树芬，等.苗药黑骨藤部分理化指标及杠柳毒苷含量的测定[J].贵州农业科学，2015（2）：130-132.

[15]Yong L，Liu Y B，Yu S S，et al.Cytotoxic cardenolides from the stems of Periploca forrestii[J].Steroids，2012，77（5）：375-381.

[16]张援虎，陈东林，王锋鹏.黑龙骨中两个新强心苷的结构鉴定[J].有机化学，2006，26（3）：329-332.

[17]甘秀海，周欣，陈华国，等.贵州苗药黑骨藤化学成分的研究[J].热带亚热带植物学报，2009，17（2）：160-163.

[18]徐冉，张援虎，赵延涛，等.黑骨藤化学成分的研究[J].中国药学杂志，2011，46（11）：823-826.

[19]赵连梅，单保恩，艾军，等.香加皮杠柳苷对人食管癌细胞TE-13生长抑制作用[J].肿瘤，2008，28（3）：203-206.

[20]张静，单保恩，李巧敏，等.香加皮杠柳苷对荷瘤小鼠的免疫调节作用[J].细胞与分子免疫学杂志，2009（10）：887-890.

[21]涂少臣，施毅.香加皮杠柳苷对小鼠骨髓瘤细胞增殖、凋亡及移植成瘤的影响及作用机制[J].福建医药杂志，2017，39（3）：71-74.

[22]林肖彬，黄宝英，卓冠航.杠柳毒苷对慢性心力衰竭大鼠的影响研究[J].中国临床药理学杂志，2019，35（21）：2672-2674.

Effects of Different Concentrations of Ethanol Solution on Extracts of Periploca forrestii Schltr.

Sun Wenjuan，Long Yi*

（College of Pharmacy，Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Ghuizhou 550025，China）

Abstract：By comparing the effects of different extracts of Periploca forrestii Schltr.on the inhibition of lymphocyte proliferation，the optimal method of extract preparation and the prediction of effective components were determined.In this study，six different extracts of P.forrestii were obtained，using different proportions of Hydro-alcoholic mixture，and these extracts were subjected to lymphocyte proliferation inhibition experiment to determine the best extraction method.Then，the content of periplocin series compounds in each extract was detected to find out whether the index was related to the immunosuppressive activity of P.forrestii，and to clarify the effect of periplocin series compounds on the immunosuppressive activity of P.forrestii.The results showed that the extraction system with less polarity was more conducive to obtain the extract with strong immunosuppressive ability.Meanwhile，the immunosuppressive ability of the extract was positively correlated with the content of periplocin series compounds.Aeries compounds of periplocin are likely to be the immunosuppressive active components of P.forrestii，which is necessary to further study the possibility of using them as quality identification indicators.

Keywords：Periploca forrestii Schltr.; extraction; active ingredients;periplocin

收稿日期：2021-06-18;

修回日期：2021-08-14

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81660710）

通讯作者：龙毅（1980—），男，博士，副教授，主要从事生物医药材料研究，E-mail：2933982231@qq.com.

1558501705346