山豆根根瘤菌的生物学特性及其不同菌株对山豆根幼苗药用有效成分的影响

唐美琼+闵丹丹+李刚

摘要：对采自广西不同地点的山豆根根瘤菌进行生物学特性研究，并将其分别接种在盆栽山豆根幼苗上，室内培养180 d后，测定植株药用有效成分苦参碱、氧化苦参碱含量。结果表明，山豆根根瘤菌为快生型根瘤菌，在YMA培养基上代谢产酸，大部分菌株的生长温度范围为25～35 ℃，酸碱耐受范围为pH值6.0～10.0，对抗生素卡那霉素（Km）、庆大霉素（Gm）敏感；不同来源的根瘤菌对山豆根药用有效成分积累的影响不同，与其他菌株相比，来自靖西县的2株菌JX2、JX3对苦参碱、氧化苦参碱的影响达到了显著水平。

关键词：山豆根；根瘤菌；生物学特性；有效成分

中图分类号： S567.21+9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0131-04

山豆根为豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）的干燥根和根茎，主产于广西，别称广豆根。山豆根具有清火解毒、消肿止痛等功效[1]，其有效成分以苦参碱、氧化苦参碱为主[2]，具有抗炎、抗心律失常、抗肿瘤等生物活性[3]。野生山豆根分布地域狭窄，零星生长于石山区石缝中，野生资源已濒临枯竭[4]。近年来，科技人员已经对山豆根的人工繁殖栽培进行研究，并取得了一定的成果[5-6]。在山豆根的栽培生产中，如果能利用豆科植物与根瘤菌的共生固氮效应满足植物对氮素的需求，对提高药材的质量及发展可持续农业、保护生态环境都有重要意义。但是目前关于豆科药材的生物固氮及其结瘤固氮对药材质量影响等相关研究甚少，对山豆根的研究更是罕见。本试验从研究山豆根根瘤菌生物学特性入手，进一步研究根瘤菌对山豆根幼苗有效成分积累的影响，以期为开发利用山豆根根瘤菌资源、提高山豆根原料药材的质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 根瘤菌的采集及分离纯化

分别在广西药用植物园、隆安县、靖西县栽培的山豆根系上采集新鲜、饱满、个大的根瘤，放入装有无水氯化钙的具塞试管内，带回实验室进行分离纯化。用自来水将采集的根瘤冲洗干净，在无菌条件下，用95%乙醇浸泡1 min后用无菌水冲洗3次，用0.1%氯化汞浸泡3 min后再用无菌水冲洗4次，然后置于灭菌的研钵中，用无菌玻棒挤压、破碎根瘤，取汁液在加有0.025 g/L刚果红的YMA平板上划线，28 ℃恒温培养至菌落出现，挑选典型单菌落进行连续培养，获得根瘤菌菌株YY、LA1、LA2、JX2、JX3（表1）。

1.2 生长特性测定

革兰氏染色参照《常见细菌系统鉴定手册》，按常规方法进行[7]。生长曲线测定：将根瘤菌接种到YMA液体培养基中，接种后每隔4h用紫外-可见分光光度计在600 mn波长处测定各参试菌株培养液的吸光度，以培养时间为横坐标、吸光度为纵坐标绘制生长曲线。溴麝香草酚蓝（BTB）反应：将菌种接种于含0.1%溴麝香草酚蓝的YMA培养基上，于 28 ℃ 培养6～10 d，观察颜色变化。

1.3 生理生化特性测定

以YMA液体培养基为基本培养基。温度试验设置共设8个单一温度和1个耐高温处理，单一温度分别设为4、10、15、20、25、30、35、40 ℃，耐高温处理先于60 ℃处理10 min，再置于28 ℃摇床中培养5 d。酸堿度影响试验：分别设置pH值为4、5、6、7、8、9、10、11、12，共9个梯度。耐盐性试验：分别设置NaCl终浓度为0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%，共5个梯度。抗生素抗性试验：添加不同浓度氨苄青霉素（Amp）、氯霉素（Cm）、卡那霉素（Km）、庆大霉素（Gm）、大观霉素（Spec）、链霉素（Sm）、羧苄青霉素（Cb）、萘定酮酸（Nm）、四环素（Tc）至YMA液体培养基中。碳源、氮源利用试验：以去掉碳源的White培养基为基础培养基，分别加入各种碳源或氮源，使终浓度为1%（质量体积分数），调节pH值至7.0。灭菌后接入供试菌株，以YMA液体培养基为阳性对照，以不加任何碳源的培养基为阴性对照，于28 ℃、200 r/min 摇床培养5 d后，显微镜下检测根瘤菌的生长状况。 以上试验均设置3次重复。

1.4 回接试验

培养基质为按1 ∶1体积混合的水洗河沙、蛭石，121 ℃高压灭菌1 h。山豆根种子来自广西药用植物园科研基地。先将山豆根种子在60 ℃左右热水中浸泡，并让其自然冷却，吸胀后分别用75%乙醇、0.1%氯化汞进行表面消毒，在无菌的水洗河沙中，于28 ℃培养至发芽，选取长势一致的植株移栽至花盆中，花盆用5%高锰酸钾浸泡5～6 h后清洗干净。

将供试菌株分别接种到山豆根幼苗根系上作为接种处理，以不接种根瘤菌为对照处理（CK），共6个处理，每个处理种植3盆，每盆15株。接种方法：移栽山豆根幼苗后，用移液枪吸取相应的根瘤菌菌液2 mL，注于幼苗根系周围，CK处理用等量的无菌水代替。将植株置于日—夜温度周期 28 ℃—22 ℃、光照度3 000 lx的无菌光照培养室内培养。用Fahraeus无氮营养液补充营养元素、水分。培养180 d 后取出植株清洗，统计山豆根幼苗根瘤数量。

1.5 苦参碱与氧化苦参碱的含量测定

测定方法参照2010年《中华人民共和国药典》（简称《药典》）[8]。以苦参碱、氧化苦参碱对照品作为试验对照，按照《药典》中山豆根测定的方法制备供试液。称取山豆根药材 0.5 g，精确加入20mL混合溶液（三氯甲烷 ∶甲醇 ∶浓氨水体积比为40 ∶10 ∶1）密塞，称质量，放置30 min，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min；再次称质量后用混合溶液补足质量，摇匀，过滤，精确量取续滤液10 mL，40 ℃减压回收（使用旋转蒸发仪）至溶剂全部挥尽，在残渣中加入适量甲醇（色谱纯）溶解，转移至容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤。另取适量苦参碱、氧化苦参碱对照品，加入液相流动相（乙腈 ∶异丙醇 ∶3%磷酸溶液体积比为80 ∶5 ∶15），使苦参碱含量为20 μg/mL，氧化苦参碱含量为150 μg/mL。仪器：高效液相色谱仪 Varian JC2X058；色谱柱：Phenomenex Luna 5 μ NH2 100 A，150 mm×4.6 mm；柱温：25 ℃；流动相：乙腈 ∶异丙醇 ∶3%磷酸溶液体积比为 80 ∶5 ∶15；检测波长210 nm；液相时间16 min。

1.6 数据处理方法

采用SPSS 16.0进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 山豆根根瘤菌的生长特性

山豆根根瘤菌在YMA平板上于28 ℃培养3～5 d能形成良好的典型菌落，其菌落呈圆形，透明黏稠，表面光滑，有光泽，边缘整齐，中心稍有突起。按菌落大小可分为2种类型，其中YY、LA2、JX3菌落直径为0.6～0.8 cm，LA1、JX2菌落直径为0.2～0.4 cm。BTB反应表明，参试的山豆根菌株代谢产酸；革兰氏染色均为阴性。生长曲线测定结果表明：各菌株在培养0～4 h为迟缓期，4～24 h为对数生长期，24 h后进入稳定生长期（图1）。由此可见，本研究分离到的根瘤菌具有快生型根瘤菌的一般特征[9]，初步判定它为快生型根瘤菌。

2.2 山豆根根瘤菌的生理生化特性

2.2.1 温度对山豆根根瘤菌生长的影响 山豆根根瘤菌对不同温度的反应较为一致，对低温的忍耐能力较差，在30 ℃左右生长良好。各菌株对异常温度的耐受性有一定的差异，来自同一产地的不同根瘤菌株对高温的耐受性也存在着差异，其中YY、LA1、JX2能耐受短时60 ℃的高温（表2）。

2.2.2 pH值对山豆根根瘤菌生长的影响 一般过酸、过碱的环境条件不利于根瘤菌的生长，山豆根根瘤菌对酸碱的反应较为一致，在pH值为 6.0～10.0时均能生长，其中LA1、JX2、JX3在pH 值为11的条件下仍能生长（表3）。由试验结果可知，山豆根根瘤菌对酸性环境较为敏感，pH值低于6.0时菌株不能再生长，但具有较丰富的耐碱种质资源。

2.2.3 NaCl含量对山豆根根瘤菌生长的影响 表4表明，山豆根根瘤菌在无盐条件下能生长，随着NaCl含量的增加，菌株生长受到抑制，当NaCl含量达到1%及以上时，菌株不能生长。

2.2.4 山豆根根瘤菌对几种抗生素的耐受性 对抗生素的敏感性是根瘤菌的重要生理生化特性，可以作为分类的指标之一。表5表明，山豆根根瘤菌株对Km、Gm的耐受性最差，在低含量（5 μg/mL）下均不能生长；对Cb表现出抗性，在较高含量（300 μg/mL）下仍能够生长；在100 μg/mL Cm、10 μg/mL Nm中都能够生长。此外，菌株间对不同抗生素或同一抗生素不同浓度的抗性差异较大，即使是来自同一地域的菌株之间也有部分差异。如来自靖西县的菌JX2、JX3对Amp敏感，相反另外2株来自隆安县的LA1、LA2对Amp（600 μg/mL）表现出抗性，而分离自广西药用植物园的YY菌株能忍耐100 μg/mL Amp。

2.2.5 碳源和氮源利用 根瘤菌一般能较好地利用单糖和双糖，而快生型根瘤菌能利用麦芽糖、乳糖、蔗糖等双糖[10]。由表6可知，山豆根根瘤菌均能利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖、果糖、乳糖，但不能利用乙酸钠、甘氨酸和肌醇。

本试验检测了供试菌株对5种氮源的利用情况，由表6可见，所有的菌株都能利用蛋白胨和硫酸铵；所有菌株均不能利用半胱氨酸；除YY外，其余菌株均能利用硝酸钾，而且YY、LA1不能利用甘氨酸，说明大部分供试根瘤菌可以利用无机氮源作为其生长所需氮源。试验结果表明，来源不同的山豆根根瘤菌对供试碳源、氮源的利用能力比较一致。

2.3 根瘤菌对山豆根幼苗有效成分的影响

接种根瘤菌能使山豆根幼苗结瘤，不同根瘤菌处理的植株苦参碱和氧化苦参碱含量是不同的。接种根瘤菌的处理，其苦参碱、氧化苦参碱含量均比对照有所增加，其中接种来自靖西县菌株的植株含量显著高于对照及其他大部分处理（表7）。由结果可见，接种根瘤菌有利于根瘤形成，再通过根瘤进行生物固氮来积累氮素，从而促进植株有效成分的积累。

3 讨论

药材原料质量是药材生产中亟待解决的问题，许多学者也在探索解决、评价药材质量的方法[11-12]。山豆根人工驯化获得成功之后，人们总结了山豆根人工栽培的一些技术措施[5-6]，但是在栽培生产中，药农为了追求产量而多施重施氮肥，造成病虫害加重、农药残留量升高、硝酸盐含量超标等问题，严重影响药材质量，这是目前山豆根可持续生产中不可忽视的问题。生物固氮是豆科植物的一个重要特性，通过生物固氮可以利用自然界的N2改善植株的氮素营养状况，从而避免盲目施氮肥造成对山豆根等豆科药材质量的不良影响。因此，筛选出具有优良特性的土著根瘤菌菌株对进一步在生产上进行接种应用是十分有利的。本试验从山豆根根瘤中获得5株根瘤菌，它们均具有快生型根瘤菌生长特征和生理生化特征。

杨亚珍等发现，不同地理来源、同一地理来源、甚至同一植株不同甘草根瘤菌菌株在个别指标方面存在差异[13]；黄荣韶等发现，不同生态环境下采集的鸡骨草根瘤菌在生物学特性方面具有较大的差异[14]。本试验结果与这些研究有相似之处，即来源相同或来源不同的山豆根根瘤菌在对高温忍耐能力、酸碱环境的适应性、抗生素的敏感性等方面存在差异，但对酸碱环境的适应性及碳源的利用能力比较一致，推测这可能与不同的菌株含有的一些特殊基因有关。通过回接试验发现，人工接种根瘤菌明显促进山豆根根瘤的形成，植株的有效成分含量大幅度提高，其原因可能是生物碱是含氮化合物，氮素的供给利用在山豆根生物碱的生物合成和积累中起重要作用。但是不同来源的山豆根菌株之间对有效成分积累的影响不同，这是否与采集地的生态环境有关，尚待进一步研究。

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