割手密细胞遗传学研究进展

张静，赵丽萍，胡鑫，姚丽，昝逢刚，覃伟，刘家勇

（1.云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南开远 661699；2.云南省农业科学院甘蔗研究所瑞丽育种站，云南瑞丽 678600）

0 引言

甘蔗作为一种糖、能兼用型植物，蔗糖是国家发展必不可少的战略物资之一。甘蔗产业发展至今，有性杂交仍然是其育种发展的关键。然而，现代甘蔗品种大多源于百年前创制的亲本以及各品种间的相互杂交，导致亲本间遗传基础同质化，新品种选育难以实现突破性进展。近年来，意识到早期育种工作中被纳入甘蔗育种的无性系遗传基础有限[1]，在收集的野生种质资源中还有许多理想性状，如耐旱、耐涝等尚未被引入商品种内，加上源自甘蔗育种进程缓慢的危机感和对生物能源的兴趣，育种家们将越来越多的目光投向了野生种质资源的利用。割手密（Saccharum spontaneumL.）又称甘蔗细茎野生种，其基因类型多样，表性差异巨大，遗传多样性丰富。割手密地理分布广泛，在南北纬40°内均有发现，遍及多个气候区。作为甘蔗属野生种的一员，其长期经受自然界优胜劣汰的选择，形成了各种抵抗生物/非生物逆境的优良特性，如根系发达、耐旱、分蘖多、生势强、宿根性好、抗逆性强等，是最早用于甘蔗杂交育种的资源，也是甘蔗属中最具价值的野外资源[2-3]。为了更深入了解、掌握国内外对割手密的研究情况，本文对其细胞遗传学研究方面进行综述，以便为割手密在甘蔗育种中的进一步开发利用提供参考。

1 割手密在甘蔗育种中的应用现状

割手密、大茎野生种（Saccharum robustumL.）和热带种（Saccharum officinarumL.）被认为是甘蔗属的3个原始种[4]。甘蔗高贵化育种技术以热带种为母本，野生种质资源为父本进行杂交，获得的后代继续作父本与热带种或栽培种进行杂交，将野生优良性状引入甘蔗的同时，保留甚至加强了后代中高贵种的高产高糖基因[5-6]。高贵化育种思路提出后，甘蔗育种家们利用该方法选育出了大量优秀的甘蔗品种和一批优秀的亲本材料[7-10]。现代甘蔗品种的高糖来源于热带种的高贵血缘，而它们的抗逆性、抗病性和宿根性则是在“高贵化”尤其是和热带种回交过程中由割手密基因的渗入带来的[1，5，11]。

20 世纪前期爪哇和印度育种家们利用热带种和割手密杂交，实现了甘蔗育种史上的第一次飞跃式发展[10，12]。据报道，爪哇甘蔗育种场JESWIET以热带种和爪哇割手密为亲本通过高贵化育种选育出了‘POJ’系列品种和亲本材料，其中‘POJ2878’被称为第一代蔗王；印度哥印巴托甘蔗育种场通过热带种、割手密和印度种之间不断杂交获得了高产高糖且抗病性良好的‘Co’系列品种[7]。美国路易斯安那州利用割手密选育出了早熟、高糖、耐寒性强的‘CP65-357’[3]。20世纪中后期，我国台湾利用台湾割手密育成了‘新台糖’系列品种[13]。

我国大陆利用割手密进行甘蔗杂交育种，最早是在1954 年，我国海南甘蔗育种场首次利用本土割手密（‘崖城割手密’）与‘POJ2878’杂交，成功获得高贵化后代‘崖城55-7’[10]。之后通过‘Badila’ב崖城割手密’、‘Crystalina’ב陵水割手密’、‘Badila’ב云南割手密’（‘云南75-2-11’）分别育成了‘崖城58-43’和‘崖城58-47’，‘崖城79-290’、‘崖城82-108’等创新材料。截至2012年，上述材料中‘崖城55-7’已育成3个品种，‘崖城58-43’和‘崖城58-47’育成30 个品种（分别为6 个和24 个）[10，14]。通过‘崖城79-290’ב崖城79-257’获得了含2 个本土割手密血缘的‘崖城84-153’，育成了‘桂糖24 号’和‘凉蔗2 号’[10]，其中‘凉蔗2 号’含有4 个不同割手密的血缘[15]。云南省农业科学院甘蔗研究所瑞丽育种站利用云南‘蛮耗割手密’育成了第一个含云南野生甘蔗种质血缘的‘云蔗99-155’[16]，而后创制出的含云南割手密血缘的‘云瑞’系列亲本也已陆续提供给各育种单位使用。目前在我国蔗区大面积推广的‘粤糖93-159’、‘云蔗05-51’、‘桂糖42 号’等甘蔗品种或多或少都含有几种割手密的血缘[12]。

然而，尽管我国对割手密资源的利用已开展多年，获得了一些含有割手密血缘的优良品种和亲本材料，但已选育出生产品种的仅有‘崖城割手密’、‘云南75-2-11’和‘陵水割手密’等少数几份[10]，相较于丰富的割手密资源（截至2020 年12 月，我国国家甘蔗种植资源圃保存的割手密资源已达961 份[12]），对割手密资源的利用显然十分有限。

2 割手密的细胞遗传学研究概况

细胞遗传学诞生后，研究者们通过多年对多种植物的研究，建立了染色体核型分析、染色体分带等经典细胞遗传学技术，为物种的起源、系统分类及植物遗传改良等提供了细胞学信息[17]。20 世纪60 年代以后，DNA双螺旋解析、显微技术和原位杂交等技术的加入使得植物细胞学和分子细胞遗传学快速发展。

2.1 割手密染色体数目研究

2.1.1 染色体总数

不同类型割手密的染色体数目存在差异，一般在2n=40～128[1，18-19]，染色体数目的不同反映了资源基因的遗传多样性。1915 年，KUWADA[20]最先报道了日本一个割手密的染色体数目为2n=68。王水琦[21]和潘世明等[22]对福建省境内搜集到的割手密进行染色体观察，发现了2n=72～102等7种类型，在国内首次报道了2n=84、88、92、96、102 几种类型。其中以2n=80、96 两种类型居多，2n=80 的类型分布最广，在福建各地均有分布，2n=72 型来自闽北，2n=88、92 大多来自闽西、北，2n=96、102 源自闽东、南。杨清辉等[23]对87 份云南割手密进行染色体数目观察，发现其有2n=60、64、70和80四种类型，其中60和70类型的割手密是国内首次报道。蔡青等[24]对国家甘蔗种质资源圃中来自9 个省区的247 份割手密进行染色体数目鉴定，得到了2n=60、64、70等共11种不同类型并将其与原生境海拔、纬度以及茎径这一农艺性状相关联，其中2n=104和2n=108两种类型为首次报道。文建成等[25]观察了源自云南、四川、福建等6 个省区的106份割手密无性系，发现了2n=60～108的11种类型，以2n=80、64、96为主，分别占据观察总数的67.0%、11.3%和9.4%。

PANJE 等[26]报道东半球不同地区442 个割手密无性系包含了31 种染色体数目类型，按照地理位置将其分为三类：东部割手密的染色体数为2n=80～112，以80、96、112 为主；中部地区的割手密为2n=40～80，以60、64、72 为主；西部地区为2n=112～128，以112、120、128为主。同时，发现染色体数为8倍数的群体似乎比其它群体具备更高的生存价值。MUTHUMANI 等[27]对印度喀拉拉邦采集的45份割手密进行细胞学研究，除‘IND9-902’为2n=72 型外，其余皆为2n=64 的细胞类型，他们推测2n=72 型可能来源于当地2n=64 和2n=80两种类型的杂交。JANAKI[28]研究了源自印度、缅甸、东印度不同地域的割手密，从中发现了2n=48、56、64、72、80、96 和112 七种类型。从染色体数目来看，该物种的染色体基数为x=8，2n=56、64 和72 的形式分别为7x、8x和9x，7x和9x类型染色体中存在一些奇特的染色体，按照预期这两类割手密的减数分裂中会出现单价和多价体，然而，JANAKI 的研究中，来自印度的许多无性系在减数分裂中都有规律地出现了28、32、36 个二价体，基于此，认为这些物种是由x=10和x=6型的物种杂交产生的二元形式。

2.1.2 染色体基数与物种进化

据D′HONT 等[29]的报道，热带种和大茎野生种的染色体基数为x=10，而割手密为x=8。ZHANG 等[11]通过研究认为割手密基本染色体数目从10 个减少到8 个，是由2 条祖先染色体的分裂和4 条染色体的易位引起的。GARSMEUR等[30]基于SNP遗传图谱提出，与热带种相比，割手密染色体基数的变异是由两对3条染色体重排在2 条染色体上引起的，这一结论在PIPERIDIS 等[31]和MENG 等[32]的研究中被加以证明。PIPERIDIS等[31]利用染色体特异性寡核苷酸探针研究了5 种割手密的染色体结构。结果显示，割手密‘Coimbatore’和‘Glagah’的染色体数目分别为2n=8x=64 和2n=14x=112，与PANJE 等[26]的研究结果一致；但‘Mo15904’与PANJE的研究结果（2n=80）略有不同，为2n=10x=79，为非整倍体，有两个尚未确定的染色体发生了易位。首次确定了割手密无性系‘SES186’和‘SES196’的染色体基数为x=9，染色体数目分别为2n=53和54，与PANJE的结果稍有出入，‘SES186’缺少了9号染色体，为非整倍体；‘SES186’、‘SES196’的9条基本染色体有7 条与热带种的相同，两条与染色体基数x=8 的割手密相同，故认为x=9与x=8 的割手密发生了重排，是x=10与x=8的中间步骤。

AITKEN等[33]通过研究提出，高粱和甘蔗两物种分化后，甘蔗中发生了多次染色体重排事件，其中2次对甘蔗的基本染色体数目产生了重大影响，导致了x=8 割手密的形成。DONG 等[34]基于高粱基因组，从割手密‘SES208’（2n=8x=64）BAC 文库中筛选出低拷贝BAC 做探针，利用FISH 技术探究了割手密与高粱两物种间的关系，证明了割手密和高粱间染色体重排事件的发生。MENG 等[35]基于高粱参考基因组成功设计合成了寡核苷酸，并针对高粱的10 条基本染色体制备了10 种特异性染色体寡核苷酸探针，将其用于割手密‘SES208’的FISH 研究，发现每一个探针都可在割手密的8 条染色体中观察到信号。通过进一步研究，认为染色体重排事件的发生可能是造成染色体基数由高粱的x=10变为割手密中x=8 的原因，基于对单条染色体的精确分析，还首次获得了同源多倍体割手密的标准核型。

在MENG 等人的另一篇报道中[32]，开发了一套基于割手密（x=8）基因组的寡核苷酸探针，通过FISH 技术同时区分八倍体‘SES208’的64 条染色体，通过FISH，论证了现代甘蔗品种中割手密和热带种染色体的重排现象；对割手密导入系‘Nepal-X’进行检测，发现其是一个染色体基数x=10的四倍体，通过细胞学和DNA 水平分析，证明了其与x=8 割手密关系密切。群体遗传结构和系统发育关系分析表明，‘Nepal-X’属于古泛马来西亚群，x=10四倍体割手密的发现表明染色体基数不同的割手密的基因组和多倍体序列具有平行进化路径。ZHANG 等[4]在高粱和热带种/大茎野生种之间检测到了71 个染色体间的重排，其中有24 个重排为热带种和大茎野生种共有，这些重排发生在两物种形成之前，通过对2 000多对割手密、热带种和大茎野生种基因对的分析，认为热带种和大茎野生种的祖先在约76.9万年前从割手密中分离出来，二者又在38.5万年前发生了分化。物种谱系发生分化后，3个甘蔗祖亲种之间有着独立的多倍体化进程[4，31，36-37]。

研究者们根据染色体计数和配对观察，提出割手密染色体基数有x=5、6、8、10 和12 几种类型，但以x=8和10较为合理，因为染色体数目多为8的倍数，其次是10的倍数[31]。导致x=8 的染色体重排可能由于选择优势[31]和/或重排后的染色体被优先传递给后代[38]，而存在被定殖于物种中的可能，或是更倾向于进一步多倍体化，从而提高了该物种的适应性，有利于割手密的地域扩展[31]。

2.2 割手密染色体核型

已有的研究表明，不论染色体的总数如何，割手密无性系之间的核型均存在差异。SREENIVASAN[18]研究了22份2n=40～126的8个不同类型割手密无性系的核型，发现了1A、1B、2A三种核型类型，揭示了同一染色体类型内及不同染色体类型之间的差异性和相似性，认为在割手密核型进化过程中染色体形态改变最小，近端着丝点染色体缺乏，中部着丝点染色体占优势，且染色体数目少的类型有着更短的染色体。MUTHUMANI 等[27]的研究中，45 份印度喀拉拉邦割手密无性系中有5 份符合1A、2A 或2B 核型，4 个无性系中存在卫星染色体；2n=64型的割手密无性系减数分裂基本规整，单价体很少，花粉育性高；而‘IND99-902’无性系（2n=72）的减数分裂过程中出现了单价体、落后染色体和染色质桥等异常行为，花粉不育。王先宏等[39]利用核型分析探讨不同基因型割手密无性系间的亲缘关系，发现10份材料中有2份为1B核型，7份2B核型，1份2C核型；供试材料中绝大多数染色体为中部着丝点染色体，少数为近中部及正中部，部分具备端部着丝点和近端部着丝点区染色体。王英等[40]采用核型分析方法对‘崖城割手密11 号’进行研究，发现其染色体数为2n=64（58～64），第19、28、30、32号染色体为近中部着丝点染色体，第31号染色体具随体，属于2A 核型。

2.3 割手密染色体行为

2.3.1 减数分裂

由于割手密染色体的着丝点大多位于中部，其减数分裂总体上是正常的，主要以二价体的形式出现[18，41-42]，减数分裂正常可以保证花粉的可育性不受或少受影响[42]。减数分裂的异常行为包括单价体、伪二价体、异形或不等二价体、染色体嵌合现象、二价体二次缔合等。SREENIVASAN等[19]研究不同割手密无性系减数分裂中出现的异常行为，在观察的28 份无性系中有21 个出现了不等二价体，末端或间隙缺失被认为是不等二价体出现的原因；14个无性系在终变期和中期存在不同数量的单价体；在3个无性系中发现了三价体和四价体；14 个无性系的染色体出现了二价体二次缔合的现象；仅在无性系‘SES503’中发现了补体分离的现象，在中期22%的花粉母细胞中，二价体被分成两组或三组，每组都有自己的纺锤体。22份不同类型的割手密中，少数无性系的减数分裂中观察到的单价体主要源于棒状二价体的过早分离，多个无性系中观察到的异形二价体被认为是染色体结构改变的证据；在9个无性系中观察到B染色体，且同一植物不同细胞中B染色体的数目存在差异，此外在多个无性系中还发现了二价体二次缔合的现象[18]。据报道[14，43]，MEBRA等发现印度2n=40、54、56、72、44的割手密减数分裂后期可以观察到染色体镶嵌、联会消失、不集合的二价体及多纺锤体和染色质桥等异常行为，并认为胚组织中染色体镶嵌是不同细胞型进化的重要因素。

在割手密杂交后代的研究中，割手密（2n=64）×河八王属的杂交后代中出现了不同数量的单价体、二价体、三价体、四价体以及落后染色体和微核[43]。JANAKI[44]发现，2n=112 的割手密与2n=20 羽蔗茅的杂交F1在减数分裂过程中会出现单、二、三、四价体，其中单价体来自于蔗茅属基因组，7 个单价体的出现伴随着一个四价体和一个三价体；同源配对后的各个时期不规则，伴有落后染色体的出现和单价体的消失，偶后出现双核四分体。

2.3.2 染色体遗传方式

与经典的细胞遗传不同，甘蔗有性杂交育种时，亲子代之间染色体的传递方式多样，且与杂交亲本相关联[7]。在甘蔗属与其近缘植物杂交的尝试中，人们发现，割手密作母本与河八王属、硬穗属杂交的后代中，分别会出现n+n、2n+n和n+2n的染色体遗传方式[43]。割手密（2n=112）与羽蔗茅（2n=20）的杂交F1（2n=66）中，亲本染色体以n+n的方式传递；对F1单株自交后获得的F2做细胞学检查发现，在F2中出现了2n=68～76、104～108 和2n=136 三种细胞类型，分别对应了n+n、2n+n 和2n+2n 三种染色体遗传方式[44]。LEKSHMI 等[45-46]发现斑茅×割手密的后代‘CYM04-420’中，亲本的染色体以n+n 的方式存在。斑茅‘GXA87-36’（2n=60）×割手密‘GXS79-9’（2n=64）杂交后代的染色体数目为2n=62，亲本杂交的染色体遗传方式为n+n[47]。黄玉新等[48]对甘蔗‘GT05-164’×斑割复合体‘GXAS’F1的5 个后代（BC1）及‘GT42’בGXAS’BC1的7 个后代（BC2）进行染色体观察，结果表明甘蔗和斑割复合体的BC1和BC2代中染色体以n+n的方式传递；割手密与斑茅的BC2和BC3中，亲本染色体亦是以n+n的方式传递[49]。

甘蔗属种间杂交过程中，D′HONT 等[50]发现甘蔗与割手密的杂交F1中，染色体的遗传方式为n+n。YU等[51]利用GISH 研究了6个甘蔗与割手密杂交F1的染色体组成，发现二者的杂交后代中出现了2n+n和n+n两种染色体遗传方式，以2n+n为主（5个），和‘崖城-409’有着相同亲本的‘崖城408’中染色体遗传方式为n+n。然而，ROACH[52]在报道中指出，n+n 传递发生在甘蔗与2n=80 割手密（做母本）的杂交中，而当割手密染色体数2n=64或2n=96的时候，这种遗传方式很少出现。PIPERIDIS等[53]证明了2n+n的遗传方式还会出现在热带种与割手密的杂交F1和BC1中。在甘蔗高贵化育种中，2n+n的染色体传递方式有利于高糖基因的富集，因此选择此杂交后代将极大地提高甘蔗育种效率[7]。

3 总结与展望

割手密在甘蔗育种中应用培育了大量优良的甘蔗品种和亲本材料，有力地支撑了甘蔗产业的发展。然而，长期的栽培种间杂交育种导致甘蔗遗传背景狭窄，甘蔗育种进程缓慢。作为甘蔗的祖亲种之一，割手密血缘的引入曾极大地提高了甘蔗品种的抗逆性和宿根性。为加快对甘蔗属野生种质资源的利用，提高育种效率，育种家们将越来越多的目光投向了割手密的研究和利用。然而，尽管现有野生割手密类型多样、分布广，但都是时空分布、长期自然选择的结果。所以笔者认为，目前割手密资源的利用存在以下两个问题：一是丰富的割手密资源利用率不足；二是距离甘蔗第一次飞跃式发展已过去百年，但相较于割手密自然选择的进程而言，短短百年时间里，割手密基因变异的有无和程度难以定论。

经典细胞遗传学核心技术为物种的起源、系统分类以及植物遗传改良等提供了基础的细胞学信息，且随着分子遗传学理论和技术快速发展与不断渗透，植物细胞遗传学迅速发展并被成功用于遗传改良、基因组解析和比较基因组、物种起源进化、染色体生物学等领域。研究表明，染色体数目的增减若引起了基因数量的增减，将引起性状表达和形态学上的差异[42]，而染色体结构的改变是甘蔗属无性系遗传变异的主要来源，其中一些变化可能对形态分化产生影响[19]。将细胞学和分子细胞遗传学技术用于割手密研究，可以判定割手密形态学分类的准确性，了解割手密的进化程度及途径，分析染色体数目和结构变异的规律与机制，对于割手密资源优良性状的挖掘和转化、割手密群体的改良、甘蔗亲本的创制意义重大。