基于网络药理学探讨金银花抗动脉粥样硬化的作用机制*

曾长林 胡子毅 魏明全※ 李人亮 张 平 易 莹

（1.江西省永修县人民医院中医科，江西 永修 330300；2.江西中医药大学附属医院急诊科，江西 南昌 330006；3.江西中医药大学，江西 南昌 330004）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病最普遍的病变基础。由于脂质沉积在动脉血管内壁，并伴有平滑肌细胞和纤维基质增生，逐渐形成分散或成片的粥样斑块，导致血管管腔变窄不稳定的粥样斑块还容易破裂出血形成血栓，从而导致急性心脑血管疾病的发生[1]。金银花首载于《名医别录》，味甘，性寒，归肺、胃、大肠经，具有清热解毒之功。现代药理研究[2，3]发现金银花具有抗炎、抑制血小板凝聚、抗氧化、提高免疫力等诸多功用。近年来有学者[4]提出运用清热解毒法防治AS。因此，本文拟通过网络药理学方法探讨金银花的药物活性成分及其治疗AS 可能的作用机制，为该药对改善AS 的体内外研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究所涉及数据库包括：中药系统药理学技术平台（TCMSP）数据库（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）、Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）、GeneCards 数据 库（http：//www.genecards.org/）、Drugbank 数据库（https：//www.drugbank.ca/）、PharmGkb 数据库（https：//www.pharmgkb.org/）、TTD 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）、String 数据库（https：//string-db.org/）。

1.2 金银花活性成分的获取及靶点的筛选 通过TCMSP数据库对金银花的化学成分进行检索，设置口服吸收利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 进行活性成分的筛选[5]，在Drugbank 数据库中查找金银花活性成分对应的有效靶点。

1.3 动脉粥样硬化靶标的预测 以“Atherosclerosis”为关键词，通过GeneCards、Drugbank、PharmGkb 和TTD数据库进行检索，去除重复及假阳性的靶点后取并集，从而获取AS 的靶标基因。

1.4 蛋白互作网络（PPI）与“药物-活性成分-靶点-疾病”网络的构建 通过Venn diagrams 在线工具将上述所获得的药物靶标与疾病靶标进行映射，取交集基因后，利用String 数据库进行靶标蛋白互作分析，物种设为“Homo sapiens”（人类），最低相互作用阈值设为最高置信度0.9“highest confidence”，其余参数保持默认设置[6]。通过Cytoscape 3.7.2 软件绘制“药物-活性成分-靶点-疾病”网络图，运用cytoHubba 插件进行核心靶点的筛选。

1.5 基因本体论（GO）分类富集分析及京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 通过R4.0.4 软件中的Bioconductor 包进行GO 和KEGG 富集分析。

2 结果

2.1 金银花的有效成分与靶点 通过TCMSP 数据库筛选出17 个活性成分，对应196 个靶标蛋白。

2.2 动脉粥样硬化靶标的预测 通过GeneCards 数据库检索出4481 个疾病靶标，设置相关系数≥1 后筛选出2371 个靶标，通过Drugbank 数据库检索出46 个疾病靶标，通过PharmGkb 数据库检索出26 个疾病靶标，通过TTD 数据库检索出22 个疾病靶标。对上述结果进行去并集并剔除重复值后，最终获得2419 个AS 靶标。

2.3 PPI 网络与“药物-成分-靶点-疾病”网络的构建 通过Venn diagrams 在线工具将金银花对应靶标与AS 靶标进行映射，共获得129 个共有靶标，即为金银花治疗AS 的关键靶标。利用String 数据库将映射所得的129 个靶点制作成PPI 网络，见图1。利用cytoHubba 插件筛选出得分最高的10 位基因依次为JUN、RELA、MAPK1、MYC、IL6、IL4、IL1B、AKT1、MAPK14 和IL2。将整理得到金银花活性成分及关键靶点导入Cytoscape 3.7.2 软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图，见图2。其中，槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、木樨草素（Luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）和豆甾醇（Stigmasterol）等的度值较高，均能与25 个以上的靶点相连接，因此推测这5 个成分可能是金银花发挥治疗AS 作用的主要活性成分。

图1 金银花治疗AS 的PPI网络图

图2 药物-成分-靶点-疾病网络

2.4 GO 与KEGG 富集分析 利用R 4.0.2 软件中的Bioconductor 软件包对129 个关键靶标进行功能富集和主要作用通路分析，其中GO 功能富集分析得到GO 条目2584 个（P ＜0.01），包括生物过程（BP）2328 个，分子功能（MF）172 个和细胞组分（CC）84 个。KEGG 通路富集筛选得到信号通路162 条（P ＜0.01），选取排名在前20 位的通路绘制气图，见图3。

图3 金银花治疗AS 关键靶标的KEGG 通路富集分析

3 讨论

AS 在中医学中无相对应病名。脂质代谢紊乱作为AS形成的主要病因，由于其临床表现与痰浊类的表现一致，故常将其归属于“痰浊”。也有学者认为AS 当属于中医的“浊毒”，认为“浊毒”与细胞炎症通路之间可能存在着一定的关联，提出浊邪伏脉是AS 形成的关键病机，进一步从“浊毒”理论探讨了AS 治疗策略[7，8]。中药网络药理学是通过构建“成分-靶点-疾病”复杂网络，从整体和系统出发，阐释和分析研究对象的药理学机制，为研究中药成分复杂作用机制提供新的思路。

本研究筛选出金银花与AS 的交集基因129 个，通过构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，我们发现槲皮素、山柰酚、木樨草素、β-谷甾醇和豆甾醇这5 个成分可能是金银花发挥治疗AS 作用的主要活性成分。研究显示槲皮素抑制小鼠腹腔巨噬细胞中氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）刺激的活性氧物种的过量生产来减轻AS[9]。山奈酚可通过其抗氧化和抗炎作用治疗AS，并通过抑制PI3K/Akt/mTOR 通路和增加内皮细胞自噬来缓解ox-LDL诱导的细胞凋亡[10，11]。木犀草素可通过在体外抑制信号转导和转录激活因子3（STAT3），减少ox-LDL 诱导的炎症，显著减轻高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠的AS[12]。β-谷甾醇可通过增加p21cip1蛋白水平抑制VSMC 增殖，进而抑制CDK2 活性，最终阻断细胞周期的进展，从而发挥抗AS 的活性[13]。豆甾醇是一种与胆固醇结构相似的植物甾醇，因其抗AS、降低胆固醇的作用而被广泛研究，修饰脂蛋白中豆甾醇的存在促进了胆固醇外流，抑制了巨噬泡沫细胞对脂质负荷的炎性细胞因子分泌[14]。

本研究通过MCC 算法筛选出金银花治疗AS 的10 个关键基因，即JUN、RELA、MAPK1、MYC、IL6、IL4、IL1B、AKT1、MAPK14 和IL2。其中IL1B、IL2、IL4 和IL6 均属于白细胞介素家族，白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B 细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。MAPK1 和MAPK14 属于丝裂原激活的蛋白激酶，与巨噬细胞胆固醇稳态和AS 基因表达有关[15]。研究JUN 证明与高胆固醇血症诱导的AS 有关[16]。RELA 是NF-κB 家族最重要的功能子单位，而NF-κB 又是炎症过程的主要调节器，在AS 中起着关键作用[17]。MYC 基因是较早发现的一组癌基因，包括c-Myc，N-Myc 和L-Myc。原癌基因c-Myc 的表达改变与细胞内氧化应激和增加的DNA 损伤有关，参与了体外和体内早期AS 形成的氧化敏感机制的启动[18]。研究[19]显示AKT1 可通过抑制Fox-O3a 及其下游基因包括凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1），在血管重塑和AS 形成过程中是VSMCs 存活的主要调节因子，AKT1 的下调抑制了血管平滑肌细胞的迁移和存活，并改善了AS 过程中斑块薄弱和心功能不全的特征。

基于KEGG 通路富集分析发现，金银花可直接作用于血脂和AS 以及流体剪切应力和AS 通路。此外还可作用于PI3K-Akt 信号通路、糖尿病并发症中AGE-RAGE 信号通路、TNF 信号通路等与AS 发生发展相关的信号通路。PI3K-Akt 信号通路是细胞中经典的信号通路，参与细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、炎症、缺血损伤和肿瘤进展等多种生理病理过程。晚期糖基化终末产物（AGEs）被广泛认为是糖尿病动脉硬化发病的重要诱导因素，糖尿病患者体内产生的AGEs 通过激活AGE-RAGE 信号通路，然后激活FSTL1 的表达，从而促使IL-1β、TNF-α 等炎性因子的表达，进一步导致AS 的发生[20]。另外TNF 信号通路也与炎症反应有关，参与AS 的发展过程[21]。

综上所述，金银花可能主要通过β-胡萝卜素、木樨草素、山柰酚和槲皮素等多种活性成分作用于JUN、RELA、IL1B、IL6 和MAPK1 等基因，可直接调控血脂和AS、流体剪切应力和AS 通路起到抗动脉粥样硬化作用。本研究发现金银花在治疗动脉粥样硬化方面具有很大潜力，值得进一步通过体内外实验进行验证。