恒温隔绝式荧光PCR 检测非洲猪瘟病毒核酸方法的建立

陈雪蓉，徐 林，王远微，汤 承，岳 华

（1.西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都 610041；2.甘孜州动物疫病预防控制中心，四川康定 626000）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，对生猪致病率及致死率高[1]。该病2018 年传入我国，给养猪业造成了重大损失[2-3]。ASF 的临床症状及病理变化与古典猪瘟（classical swine fever，CSF）和猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）相似，只能通过实验室才能确诊。目前尚无有效预防ASF 的疫苗，及时准确的诊断对ASF 防控至关重要[4]。PCR 现已广泛用于多种动物病原的检测[5]。我国农村农业部推荐使用传统荧光定量PCR 检测方法进行ASF 诊断，但该方法需要复杂的仪器，耗时较长。恒温隔绝式荧光PCR（insulated isothermal PCR，iiPCR）是一种基于Rayleigh-Benard 对流原理设计的新型荧光PCR 技术，在配好检测体系后仅需将毛细管放入仪器内，一键启动，无需设置扩增程序和分析扩增曲线，可自动在显示屏上显示检测结果。该方法对于DNA 和RNA 检测都具有极好的灵敏度和特异性[6]。与实时荧光定量PCR、琼脂糖凝胶电泳鉴定的传统PCR 或热循环式PCR 技术不同，该技术实现了核酸分析仪的小型化，让PCR 检测走出实验室，实现现场检测。目前，iiPCR 检测技术已被广泛用于多种动物疫病的快速检测[7-13]。

1 材料与方法

1.1 病毒核酸和临床样本

猪细小病毒（PPV）WH-1株、猪瘟病毒（CSFV）兔化弱毒株、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GDr 株、猪伪狂犬病病毒（PRV）Bartha-k61 株、猪乙脑病毒（JEV）SA14-14-2 株，均购于中国兽医药品监察所；猪流行性腹泻病毒（PEDV）分离株swun620、ASFV 核酸，由西南民族大学动物医学实验室提供，用于特异性评价。

51 份ASFV 阳性样本核酸及49 份ASFV 阴性样本，均由西南民族大学动物医学实验室（四川省ASF 定点检测实验室）提供，用于检测方法的比较。

1.2 主要试剂

pMD19-T 克隆载体、DH5α 感受态细胞、DL 500 DNA Marker、TPremix ExTaq（Probe qPCR Mix），购于宝生物工程（大连）有限公司；Gel Extraction Kit 胶回收试剂盒，购于OMEGA BIOTEK 公司；PetNAD 核酸萃取试剂盒，由金瑞鸿捷（厦门）生物科技有限公司生产提供。

1.3 主要仪器

移液器，购自德国Eppendorf 公司；核酸蛋白分析仪，购自日本岛津公司；电泳仪及凝胶成像系统，购自上海天能科技有限公司；荧光定量PCR仪（Quant Studio 3），购自杭州博日公司；小型离心机（cubee™）、POCKIT Micro Plus 核酸八通道分析仪，购自厦门金瑞鸿捷公司。

1.4 引物合成

采用农业农村部172 号公告推荐的ASFV 荧光定量PCR 检测方法的引物（F：5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'；R：5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'）和探针（5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'）。扩增P72基因目的片段，长度为63 bp。引物和探针，均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 核酸提取

用于特异性检验的毒株，均采用酚-氯仿-异戊醇法和Trizol 法提取DNA 和RNA。DNA 于-20 ℃保存备用，RNA反转录成cDNA保存于-20 ℃。

1.6 ASFV 标准样品准备

采用1.4 中的引物对，以ASFV 阳性的DNA为模板进行常规PCR 扩增，PCR 产物经3%琼脂糖凝胶电泳，目的条带用Gel Extraction Kit 胶回收试剂盒回收并连接到pMD19-T 载体上，随后转化DH5α 感受态细胞，筛选阳性克隆并提取质粒，将测序正确的阳性质粒作为本研究的阳性标准品，用核酸蛋白分析仪测定其质量浓度（μg/mL），按照下述公式换算成copies/µL。

阳性标准品浓度（copies/µL）=阳性标准品质量浓度×10-9×6.02×1023/（660×质粒总长度）。

1.7 反应体系优化

采用50.00 µL 反应体系，对体系中的上下游引 物浓 度10 µmol/µL（0.50～5.00 µL）、探针 浓度10 µmol/µL（0.05～0.50 µL）、Taq预混酶5 U/µL（22.00～28.00 µL）进行优化。以PCR 检测前读取的荧光值（A520）与检测后读取的荧光值（B520）的比值R1 最大，为最佳体系的判定标准。

1.8 特异性评价

用本研究建立的检测ASFV 核酸的 iiPCR 方法，对PPV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PEDV的核酸进行检测，以ASFV 核酸作为阳性对照，去离子水作为阴性对照，对阳性核酸扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序，以评价ASFV iiPCR方法的特异性。

1.9 灵敏度测定

用本研究建立的检测ASFV 核酸的 iiPCR 方法，对阳性标准品梯度稀释（10-1～10-14）后进行检测，以去离子水作为阴性对照，测定本研究建立的iiPCR 方法的检测下限。

1.10 稳定性评价

用本研究建立的 iiPCR 方法，对6 个稀释度的ASFV 重组质粒标准品（10-6～10-11）进行检测，每个稀释度设3 个复孔，评价其批内重复性；同时以这些阳性标准品为模板，每间隔1 d，进行3 次独立检测，检测其批间重复性。

1.11 与传统荧光定量PCR 方法比较

采用本研究建立的iiPCR 方法和农业农村部172 号公告推荐的荧光定量PCR 方法，同时对51份ASFV 阳性样本核酸及49 份ASFV 阴性样本进行检测，比较两种方法的检出情况。

2 结果

2.1 反应体系优化

本研究建立的检测ASFV 的 iiPCR 方法的优化反应体系见表1。

表1 优化的ASFV iiPCR 反应体系

2.2 特异性

用本研究建立的检测ASFV 的iiPCR 方法，从ASFV 阳性样本中扩增目的片段，测序结果证明目的片段为63 bp，是ASFVP72基因的特异片段，而 对PPV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PEDV的核酸样本扩增结果均为阴性，表明建立的ASFV iiPCR 检测方法特异性良好（图1）。

2.3 检测限

用核酸蛋白分析仪测定ASFV 阳性标准品的质量浓度为176 μg/mL，代入1.6 的公式换算核酸浓度为2.55×1012copies/μL。对标准品进行倍比稀释（2.55×1011～2.55×100copies/μL）后，iiPCR 方法灵敏度检测结果显示，该方法对ASFV 核酸最低检测限为2.55 copies/μL（图2-A），与农业农村部推荐的荧光定量PCR 方法灵敏度检测下限一致（图2-B），说明本研究建立的方法具有较好的灵敏度。

2.4 稳定性

稳定性试验结果见表2。该方法的批内变异系数为0.61%～1.79%，批间变异系数为0.82%～1.86%。对6 个浓度阳性标准品检测的变异系数均小于2%，表明建立的ASFV iiPCR 方法稳定性好。

表2 iiPCR 稳定性测试结果

2.5 与传统荧光定量PCR 的符合率

用本研究建立的iiPCR 与传统荧光PCR 检测的符合率见表3。计算公式：符合率=TN/（TN+FP）×100%（TN 为真阴性，FP 为假阳性）。从表3 可见，本研究建立的iiPCR 方法和农业农村部推荐的荧光定量PCR 方法，对ASFV 阳性样本和阴性样本中核酸检出结果一一对应，完全一致，表明本研究建立的检测ASFV 的iiPCR 方法准确可靠。

表3 两种检测方法对ASFV 的检测结果

3 讨论

3.1 实现了ASFV 的现场诊断

传统的荧光定量PCR 测定需要大型、复杂、昂贵的仪器，这些仪器只能存放在实验室中，且检测时间较长。现场诊断技术可以解决这些问题，并可避免运输传染性材料导致的一些潜在危险[14]。目前已经开发了一些便携式分子检测方法，用于快速现场检测ASFV[15-20]。但国内还未见有ASFV iiPCR 现场检测方法的报道。基于iiPCR 原理研发的POCKIT™ 智能型核酸分析仪，小巧便携，自带电源，PCR 检测一键操作，检测过程仅需42 min，且因检测过程在闭管内一次完成，避免气溶胶的产生，已被广泛运用于牛轮状病毒[9]、牛传染性鼻气管炎病毒[11]、猪轮状病毒[10]、PEDV[21]、虾白斑病病毒[22-23]、马流感病毒[24]、犬瘟热病毒[25]等动物疫病病原的快速检测，其中采用该技术建立的对虾白斑病病毒检测方法已得到OIE 认证[22-23]。本研究建立的iiPCR 方法配合现场使用的核酸提取试剂盒[21]即可实现ASFV 检测的现场化，具有很大的应用潜力。

3.2 实现了ASFV 现场检测的标准化

PCR 是目前我国ASFV 检测的主要手段。关于该病毒的PCR 检测方法很多，如普通PCR、荧光PCR 等，但这些PCR 检测方法均需专业实验室，操作过程较为繁琐，耗时较长[26-28]。且不同方法因检测靶点、反应体系和条件的不同，导致的特异性、通用性和敏感度等指标有很大差异，对检测结果具有很大影响。面对ASF 等需要封锁、扑杀的一类动物疫病，诊断方法的标准化至关重要。本研究建立的ASFV iiPCR 检测方法的最低检测限以及对ASFV 阴阳性样本的检测结果，均与农业农村部172 号公告推荐的荧光定量PCR 方法一致，说明本方法能替代推荐的荧光定量PCR 方法，实现对临床样本的现场检测，且速度更快，操作更简捷，为ASF 诊断提供了可靠的现场诊断新方法。