新疆和静县羊源多杀性巴氏杆菌分离鉴定及耐药性分析

张继红

（新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐 830011）

近年来随着我国养殖业的迅速发展，牛、羊、鹿等反刍动物的养殖数量呈现逐年增高的趋势，其中羊养殖成为家畜养殖业的主要组成部分[1]，开始从完全放牧模式向规模化舍饲模式发展[2-3]。许多地区羊舍环境空间不足或受限制，导致羊饲养密度较大、羊舍卫生条件较差，容易造成羊呼吸疾病的发生和流行[4]。多杀性巴氏杆菌是临床中常见的典型人兽共患病病原菌之一，可以引起羊、牛、马、猪、鸡、鸭等多种动物和人发病，其感染不同种类动物引起的疫病名称有所不同，如禽霍乱、猪肺疫、牛出血性败血症、兔出血性败血症等[5-6]。多杀性巴氏杆菌可引起感染动物的急性败血症症状或慢性症状，其中急性症状可导致死亡，慢性症状可使动物生长、生产性能下降[7]。国内相关研究表明，近几年来多杀性巴氏杆菌对羊、牛等反刍动物产生的危害较严重，尤其是对哺乳羔羊，具有发病急和死亡率高的特点，给羊养殖业造成了巨大经济损失[8-9]。

和静县为新疆地区的牛羊养殖大县。据和静县畜牧局2020 年数据统计，全县牛羊年末存栏超过115 万头（只），年出栏超过98 万头（只），牛羊肉类总产量为2.48 万t。因此，和静县的羊巴氏杆菌病防控对于保障养羊业健康发展具有重要意义。为了解和静县羊群中多杀性巴氏杆菌的致病性及耐药情况，2019—2021 年采集规模场及散养户中患呼吸道疾病病死羊的病料样品进行多杀性巴氏杆菌分离鉴定，并检测其致病性及耐药性，以期为该地区羊群巴氏杆菌病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2019—2021 年采集和静县规模场及散养户中患呼吸道疾病羊的咽拭子、病死羊的肺脏等病料组织样品304 份，4 ℃保存备用。

1.2 主要试剂与仪器

营养肉汤、脑心浸液培养基（BHI，含5%胎牛血清），均购自北京陆桥生物科技有限公司；瑞士染色液，购自南京建成科技有限公司；蔗糖、卢戈氏碘液、氯化钠，均购自宝生物工程（大连）有限公司；高速离心机（5418 小型），博科（BIOBASE）公司产品；高清显微镜（YKT-8400 型），上海永科光学仪器有限公司产品。细菌生化检测试剂盒、药敏纸片，均购自北京天坛药物生物技术开发公司；7%绵羊血脱纤培养基，由本单位动物疫病检测实验室自制；22～25 g 昆明系小鼠，由新疆维吾尔自治区动物卫生监督所动物疫病检测实验室提供。

1.3 细菌分离鉴定与培养

将采集的病料组织样品处理后，接种于7%绵羊血脱纤培养基，37 ℃培养12～24 h；挑取单个典型的菌落接种于脑心浸液琼脂培养基，37 ℃培养12～24 h；挑取单个菌落进行瑞士染色镜检，观察其形态学结构。

1.4 生化试验鉴定

挑取脑心浸液琼脂培养基典型的菌落，接种于营养肉汤中进行纯化培养；取纯化培养的分离菌株，按照细菌生化检测试剂盒说明书进行分离菌株生化鉴定。

1.5 PCR 鉴定

根据GenBank 中登录的多杀性巴氏杆菌基因序列，设计特异性鉴定Kmt1基因的引物序列（F：5'-CGCTATTTACCCAGTG-3'；R：5'-CGTTGAACACGAAGA-3'）进行PCR 鉴定。目的基因大小为460 bp。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。用水煮法制备分离菌株DNA模板，进行PCR 检测。PCR 产物送上海生工进行基因测序，测序结果与GenBank 中登录序列进行同源性对比。判定标准：同源性≥99.0%，定义到种的水平；97.0%～99.0%，定义到属的水平；＜97.0%，定义到科的水平。

1.6 致病性试验

参考文献[10]的方法，将纯化培养的分离菌株培养至对数期后计数，调整菌液浓度至107～108CFU/mL，每株分离菌株腹腔注射5只小鼠，剂量为0.2 mL/只，对照组接种等量的无菌营养肉汤。接种12 h 后，观察小鼠的发病及死亡情况，并对死亡小鼠进行细菌分离鉴定，并统计致病菌株。

1.7 耐药性试验

参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2017 推荐的标准K-B 纸片法进行药敏试验和药敏结果判断，分析耐药性。耐药率=耐药菌株数/试验菌株×100%。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定与培养

分离菌株在7%绵羊血脱纤培养基平板上生长良好，不呈现溶血；在脑心浸液琼脂平板上长出湿润的灰白色水滴样菌落，且生长良好；瑞氏染色可见椭圆形杆状、两极浓染、中间不着色、单个或多个散在排列的菌落，培养特性和细菌形态与《伯杰氏系统细菌学手册》报道的多杀性巴氏杆菌培养特性与形态学基本一致。

2.2 细菌生化鉴定

用细菌生化检测试剂盒，对分离菌株进行生化鉴定。结果显示，分离菌株的生化鉴定特性与多杀性巴氏杆菌相符。经统计，共有124 株分离菌株被鉴定为多杀性巴氏杆菌，分离率为 40.8%。

2.3 PCR 鉴定

对分离的124 株菌株，用多杀性巴氏杆菌特异性鉴定Kmt1基因引物，均扩增出约460 bp 的目的基因条带（图1），测序结果与GenBank 中登录的参考株基因序列同源性在98.9%以上，参照判定标准，可以判定为多杀性巴氏杆菌。

2.4 致病性试验

用分离的124 株分离菌株攻毒小鼠，2～5 d 内小鼠出现精神沉郁、抽搐、扎堆、采食量减少等不同临床症状，个别小鼠出现急性死亡。剖检死亡小鼠发现，肺脏、脾脏、肾脏等实质器官肿大、出血，个别肝脏上出现浅白色坏死点。对照组小鼠健康。经统计，分离的124 株菌株中，有87 株可引起小鼠死亡，对小鼠的致死率为40%。

2.5 耐药性分析

耐药分析结果（表1～2）显示：分离的87 株致病性多杀性巴氏杆菌耐药严重，对阿莫西林、多西环素、链霉素、氨苄西林、红霉素、大观霉素、庆大霉素、磺胺间甲氧嘧啶、新霉素等9 种药物的耐药率为44.8%～100%，对头孢噻呋、头孢噻肟、恩诺沙星、替米考星、环丙沙星、多黏菌素、氟苯尼考7 种药物的耐药率为2.3%～36.9%；87 株致病性多杀性巴氏杆菌均呈现多重耐药，其中有1 株菌株对18 种药物全部耐药，其他菌株主要表现为耐9～11 种药物（44.8%）。

表1 耐药性分析结果

表2 多重耐药性统计结果

3 讨论

相关研究[10-11]表明，多杀性巴氏杆菌是临床中常见的条件致病菌之一。正常情况下，该菌主要存在于动物的口腔、咽部黏膜中，在转群、换料、运输、外界条件突然改变等应激因素刺激下，均可以引起感染动物发病，导致出现败血症和呼吸系统急性症状，严重者可以引起急性死亡。多杀性巴氏杆菌是引起羊呼吸道疾病的主要病原菌，在羊群中的感染率和引起的死亡率均较高，给羊养殖业带来了巨大经济损失。马雪等[9]从表现病症的萨福克羊呼吸道中分离到6 株多杀性巴氏杆菌，魏诗谣等[12]从病死羊的肺脏组织中分离到3 株D 型多杀性巴氏杆菌，本研究也从患呼吸病的羊体内分离到87 株致病性多杀性巴氏杆菌。上述研究表明，该菌是引起羊呼吸道疾病的重要病原菌，且在羊群中广泛流行，危害较大，应该引起注意，需采取综合性防控措施。

巴氏杆菌病目前没有有效疫苗预防，主要使用抗菌药物防治。但临床中抗菌药物的滥用导致临床分离菌株对常用抗菌药物的敏感性下降，使得该病的防治形势更为严峻[13-14]。因此，在临床中应该注意抗菌药物的合理使用。本研究发现，分离的87 株致病性多杀性巴氏杆菌耐药较严重，且呈现多重耐药，应引起重视。吴同垒等[10]报道，从河北省部分地区肉牛群中分离的多杀性巴氏杆菌对复方新诺明、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和林可霉素等药物耐药性较高，马雪等[9]报道从萨福克羊中分离的多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物产生了较强耐药性，魏诗谣等[12]报道分离的3 株D 型羊源多杀性巴氏杆菌对多黏菌素B、多西环素耐药较严重。因此，在临床中防控多杀性巴氏杆菌引起的相关疾病时，应该根据药敏试验结果，选择敏感药物合理使用。多杀性巴氏杆菌对消毒剂抵抗力不强，因此可以结合环境消毒进行综合防控。