滇西保山地区4种农田生态系统土壤中虫生真菌物种多样性

陈自宏,陈 凯,徐 玲,柳 青,张云娇,石龙敏,彭兴艳,陈家富

(1.保山学院高黎贡山生物资源研究所,云南 保山 678000; 2.云南省高校滇西昆虫资源保护与利用重点实验室,云南 保山 678000)

【研究意义】农田生态系统是一种以农作物为中心、受人为干扰强烈的半自然生态系统，由于受人类有目的的选择和控制，其植被类型和群落结构相对较单一[1]。研究农田生态系统中虫生真菌的自然发生状况，对农业害虫的综合管理和持续防控具有重要意义。【前人研究进展】随着农业生产力的提高和全球经济变化加速，环境日益多变，害虫危害剧增，化学农药的大量施用造成环境污染不断加重，给农田生态系统的可持续性发展带来了巨大压力[2-3]。虫生真菌是自然界中控制害虫种群消长的重要因子，对害虫的防治具有安全有效、容易大量生产、容易流行等优点，利用虫生真菌防治农业害虫已成为新趋势[4-5]。自然界中虫生真菌资源丰富，分布广泛。近年来，关于虫生真菌物种多样性的研究非常多，但多数集中在森林、自然保护区等植被种类较丰富的生态系统中[6-8]，对农田生态系统中虫生真菌资源的关注较少。【本研究切入点】保山是滇西农业综合开发区，属低纬高原季风气候，海拔差异大、地势地形复杂、地貌特征多样，适合耕种的土地类型多样，作物种类丰富。保山潞江坝是典型的亚热带干热河谷，年均气温21.3 ℃、积温7694 ℃，是云南享有盛誉的热作种植区[9]。保山腾冲市是中国著名的内陆型火山地热区，年均气温14.7 ℃，积温4613 ℃，其火山灰土肥力优异，在农业用地中占据重要地位[10-11]。【拟解决的关键问题】在保山市2个区域的4种典型的农田生态系统中开展虫生真菌物种多样性及其发生动态研究，为挖掘该地区农田生态系统虫生真菌的应用潜力和持续控制农业害虫奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2018年在云南省保山市潞江坝热作种植区和腾冲火山灰区选取4种农田开展虫生真菌的调查(表1)。多年生作物农田：潞江坝咖啡田、腾冲市茶园，均无混栽或间作植物；1年生作物农田：潞江坝玉米田，玉米(4—9月)与四季豆(9月至下一年3月)轮作；腾冲的烟田，烤烟(5—10月)与油菜(上一年10月至4月)轮作。

每种作物农田选取6个样方(两样方间隔5 km以上)。每个样方总面积为400 m2(20 m×20 m)，取4个对角小样方和1个中心小样方(每个小样方为2 m×2 m)。1—12月，每月中旬在每种农田样方中采集植株根际土壤样品30个，各样品带回实验室后于4 ℃下暂时保存，并在3 d内处理。

1.2 虫生真菌菌株分离纯化与鉴定

参考Keyser等[12]的方法，用黄粉虫诱导法从各土壤样品中分离虫生真菌菌株。取200 g土壤样品转移至无菌罐头培养瓶中，每瓶放入10只黄粉虫幼虫，被感染后，挑取虫体表面分生孢子粉或取虫体内部组织，于PPDA培养基(PDA培养基+1%蛋白胨)上25 ℃培养，获得的纯化菌株于4 ℃保存。

根据菌落形态、营养体、孢子等形态特征对分离纯化到的菌株进行初步分类鉴定，再结合5基因序列(nrSSU,nrLSU,EF-1α,RPB1和RPB2)的系统发育分析来确定虫生真菌的分类地位[13-14]。

1.3 数据统计与分析

多基因系统发育分析：根据近年来的研究报道[13,15-16]，在GenBank数据库中检索并下载已登录的虫生真菌5基因序列。每个物种中选取1～2个代表性菌株(共选取了30株菌)显示在系统发育树上，将其5基因序列上传到GenBank并获得序列号。对每个基因数据矩阵序列进行比对，片段的缺失用“N”表示，将5基因数据矩阵序列进行拼接合并，以Clonostachysrosea和Hydropisphaerapeziza作为外类群，用RAxML软件进行多基因系统发育分析。

物种多样性分析：不同类型作物农田中虫生真菌的数量特征采用α多样性进行分析，物种丰富度指数、物种多样性指数、均匀度指数和优势度指数用R2.12.1软件进行统计分析[17]。优势种：菌株数占比>9%，菌株数占比(%)=物种菌株数/总菌株数×100%。

表1 采集地点的自然概况

2 结果与分析

2.1 保山农田生态系统虫生真菌物种多样性

从保山4种农田生态系统的土壤中诱导分离纯化虫生真菌，结合形态特征和多基因系统发育分析，共确定了3340个菌株属于虫生真菌。参与多基因系统发育分析的组合序列共93条，在系统发育树(图1)中被分为10个类群(clade 1～10)，外类群物种(ClonostachysroseaGJS90-227,HydropisphaerapezizaGJS92-101)序列明显形成了1个独立的分支(clade 10)。保山农田虫生真菌分属于3科(麦角菌科、虫草科、线虫草科)6属20种，麦角菌科包含1个属：绿僵菌属(clade 9)8种(Metarhiziumanisopliae,M.baoshanense,M.brunneum,M.gaoligongensis,M.indigotica,M.pemphigi,M.pinghaense和M.rileyi)；虫草科包含3个属：白僵菌属(clade 4)4种(Beauveriaasiatica,B.bassiana,B.brongniartii和B.pseudobassiana)，虫草属(clade 5)5种(Cordycepscateniannulata,C.cateniobliqua,C.fumosorosea,C.militaris和C.tenuipes)，刺束梗孢属(clade 6)1种(Akanthomycessp.)；线虫草科包含2个属：线虫草属(clade 7)1种(Ophiocordycepsmyrmicarum)，紫孢菌属(clade 8)1种(Purpureocilliumlilacinum)(图1，表1)。

2.2 保山4种农田生态系统虫生真菌的分布

保山4种农田生态系统中虫生真菌的物种和菌株数都比较丰富(表2)。从物种来看，腾冲火山区的茶园和潞江坝热作区的咖啡田虫生真菌物种丰富度(分别为18和17种)和多样性指数较高(分别为2.150和2.161)，潞江坝玉米田和腾冲烟田的物种丰富度(分别为13和12种)和香农多样性指数(分别为1.697和1.974)相对较低。从菌株数来看，茶园虫生真菌的菌株数量最多(1087株)，其次是咖啡田(858株)；玉米田的菌株数量较少(774株)，烟田的菌株数最少(621株)。

表2 保山4种农田生态系统中虫生真菌的物种及其数量

保山农田虫生真菌的基因序列进行字体加粗显示Those from Baoshan field ecosystemwere showed in bold type图1 保山农田生态系统虫生真菌多基因(nrSSU,nrLSU,EF-1α,RPB1和RPB2)系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of entomogenous fungi in Baoshan field ecosystem based on multigene (nrSSU,nrLSU,EF-1α,RPB1 and RPB2) dataset

表3 保山4种农田生态系统种土壤虫生真菌优势属和种的菌株数量占比

获得的20种虫生真菌中，金龟子绿僵菌(茶园)和斜链虫草(咖啡田)只在1种农田中发现；高黎贡绿僵菌、环链虫草、高雄山虫草和蛹虫草在咖啡田与茶园中发现，靛青绿僵菌和莱氏绿僵菌在玉米田和茶园中发现，红蚁线虫草在咖啡田和烟田中发现；其余11个物种在4种农田中均有分布(表2)。

保山农田生态系统土壤中虫生真菌优势种属现象明显(表2～3)，玉米田和烟田虫生真菌的优势度较高(分别为0.252和0.191)，咖啡田和茶园虫生真菌的优势度较低(分别为0.161和0.175)。绿僵菌属、白僵菌属和虫草属在4种农田生态系统中都为优势属，这3个属共有17个物种，菌株数(2809株)占农田土壤总菌株数的84.10%。尤其是第一优势属绿僵菌属，其物种数(8种)最多，菌株数占农田土壤总菌株数的64.76%；第二优势属为白僵菌属(4种，菌株数占13.32%)和虫草属(5种，菌株数占6.02%)。而紫孢菌属和刺束梗孢属虽然菌株数也较多(分别占总数的9.94%和5.66%)，但分别都只发现1个物种；线虫草属中也只有1个种，菌株数最少(10株)。

保山农田生态系统20种虫生真菌中，菌株数量≥300株的优势物种有4个：M.brunneum、M.baoshanense、Purpureocilliumlilacinum、Beauveriabassiana。菌株数量≤10的稀有物种有4个：M.rileyi、M.anisopliae、C.cateniobliqua和O.myrmicarum。从表3可见，M.brunneum为第一优势物种(总占比为34.25%)，在不同类型农田土壤中都最占优势(28.79%～39.92%)，玉米田检出的菌株数最多(占39.92%)，咖啡田菌株数最少(占28.79%)。第二优势种为M.baoshanense，在保山农田生态系统总占比为19.91%，在各种农田土壤中的数量占比为16.83%～24.16%。P.lilacinum和B.bassiana在4种农田土壤中的分布也占一定优势，其菌株数总占比分别为9.94%和9.58%。

2.3 保山4种农田生态系统虫生真菌不同月份的消长动态

从图2可见，一年中每个月份保山4种农田生态系统土壤中都有虫生真菌的分布，菌株数量具有相似的季节分布规律，夏季(6—8月)菌株检出率较高，春季(3—5月)和秋季(9—11月)较少，冬季(1—2月和12月)最少。其中，7月的菌株检出率最高(498株，占总数的15.1%)，1—7月菌株数量逐渐增多，7—12月菌株数量逐渐减少。

不同类型作物农田的虫生真菌在一年内不同月份的分布不同。总体来看，茶园中各月检出的菌株数都为最高，咖啡田为其次，玉米田较低，烟田各月的菌株数量最少(可能受烟碱等抑菌抗虫物质的影响)。茶园、咖啡田和玉米田在7月菌株数量较接近，都达到顶峰，茶园主要在1—5月和9—12月的菌株数量远高于其它农田，从而拉开差距，说明茶园在春秋冬季比其它3种农田更适宜虫生真菌的繁衍。不同作物农田的消长动态波动幅度略有不同，玉米田2月和8月的菌株数量略高于咖啡田，烟田6月和10月的菌株数量略高于玉米田。不同栽培模式对虫生真菌的分布有影响，一年生作物农田(玉米田和烟田)中虫生真菌菌株数低于多年生作物农田(茶园和咖啡田)。

图2 保山典型农田生态系统虫生真菌不同月份的消长动态Fig.2 Monthly fluctuation of entomogenous fungi in Baoshan field ecosystem

3 讨 论

在保山4种类型农田土壤中分离到3340株虫生真菌菌株，包括了3科6属20种，说明保山农田生态系统虫生真菌资源丰富、物种多样性也较高。王品[18]从中国8省4大茶区土壤中分离的虫生真菌有4属11种。郭先见等[19]在安徽黄山市汤口镇茶园分离到1041株虫生真菌，属于6属13种。这些研究表明，农田生态系统中也存在多种类型的虫生真菌能适应其生境。保山气候温暖湿润，调查的2个区域(潞江坝和腾冲)的生态条件较好，属于典型的山地生态系统，植被资源丰富，是虫生真菌野生资源的天然储藏库，有利于虫生真菌向农田扩散分布。

农田生态系统受人为扰动较大，生物多样性往往低于同地区的自然生态系统[1,20]。本课题组前期在保山市太保山森林公园进行了为期一年的调查，分离到3科9属24种共计395株虫生真菌菌株[21]。保山市2个地区4种农田全年获得的菌株数量(3340株)远超过太保山森林公园(395株)，但物种丰富度相对较低(4种农田中共20种，太保山24种)。这说明农田生态系统的土壤营养丰富，有利于虫生真菌菌株数量的增加，而山地生态系统的生境多样性更有利于虫生真菌的物种多样性分布。刘玉军等[22]报道安徽歙县油茶林虫生真菌的个体数量较丰富，但物种多样性指数较低。李巧等[20]研究紫胶林—农田复合生态系统中甲虫的多样性，发现天然紫胶林的生物多样性最高，人工紫胶林其次，两种农田(稻田和旱田)的生物多样性最低。

农田生态系统的不同作物系统存在特异性，其间害虫具有空间异质性[23]，那么其虫生真菌也应该存在空间异质性。保山农田生态系统中，同一地理分布的不同作物农田中虫生真菌的种类和数量有较大差异。茶和烤烟两种作物的农田调查样地都分布在腾冲地区，气候条件(亚热带季风气候)和地质土壤构造(火山灰土)比较一致，但茶园虫生真菌物种(18种)和菌株数最多(1087株)，烟田最少(12种，621株)；而分布于不同地理区域的茶园(腾冲)和咖啡(潞江坝)虫生真菌的物种丰富度又较接近(分别为18种和17种)。较多种类(11种)的虫生真菌在4种农田生态系统中都有分布，而只在某些类型农田中分布的虫生真菌(9种)也没有显示出地理区域特异性(如：高黎贡绿僵菌等4种真菌分布于潞江坝的咖啡田与腾冲的茶园中，靛青绿僵菌和莱氏绿僵菌分布于潞江坝的玉米田和腾冲的茶园中，红蚁线虫草分布于潞江坝的咖啡田和腾冲的烟田中)。Wakil等[24]调查了旁遮普和巴基斯坦不同地理区域中虫生真菌的分布，认为地理属性对储粮害虫虫生真菌的发生状况影响较大。保山市虫生真菌的分布受地理区域的影响小，究其原因，调查地(潞江坝和腾冲)同在一个区域，虽然两地年积温有所差异，但整体上地理环境条件差异不够大，对虫生真菌分布的影响不明显。

农田生态系统中生物的种类和数量受农作物品种、栽培模式、施肥、农药施用等耕种措施的影响[1]。保山多年生作物农田(茶园和咖啡田)中虫生真菌的种类和数量都高于一年生作物(玉米田和烟田)。Hummel等[25]对北卡罗来纳州西部蔬菜地土壤虫生真菌的研究认为，耕作模式是影响虫生真菌生存和繁衍的主要因素。保山农田虫生真菌的发生也主要与栽培的作物种类和作物栽培模式有关。不同栽培模式，农田受人为扰动程度不同。茶园和咖啡田为多年生作物，涉及农事活动主要为除草、施肥等处理，受人为扰动较少。玉米田和烟田为一年生轮作种植，涉及除草、施肥、深耕、晒地等农事活动，受人为扰动大。王品等[18]认为，适当的人工干预能改善茶园的生态环境，提高虫生真菌多样性。但从研究结果看，人工扰动过多，势必降低虫生真菌的多样性和种群数量。刘玉军等[22]认为，粗放管理的油茶林比精细管理的油茶林中植物多样性较高，虫生真菌也有相似的规律。

保山4种作物农田虫生真菌都具有相似的季节分布规律，夏季菌株数量最多，王品[18]、郭先见等[19]，及刘玉军等[22]的研究有相似结果。茶园在各个月份虫生真菌的数量都最高，尤其是春秋冬季远高于其它3种类型作物的农田，说明茶园生态系统更利于虫生真菌的大量繁衍。关于茶园虫生真菌有不少研究报道[18-19,22]，都认为茶园虫生真菌种群数量丰富。烟田中虫生真菌在各个月份都较低，在温度最高的7月份也未见大的增幅。不同作物农田虫生真菌在不同月份的波动幅度略有不同，可能受温湿度变化等因素的影响。

笔者前期对高黎贡山虫生真菌的研究[26]发现，森林生态系统中虫生真菌多数优势种具有生境类型偏好性。保山农田生态系统中虫生真菌优势种的生境偏好性较弱，几个优势种在4种作物农田中都处于优势地位。分析原因为，与森林生态系统相比，农田生态系统的不同生境因素差异相对较小，适宜生长的虫生真菌在不同类型农田中都能大量繁衍形成优势地位。

农向群[27]认为，在农田耕地和邻近草地中绿僵菌比白僵菌更常见，从农田中分离到绿僵菌的几率比林地的要高得多。本研究结果也显示，与同地区的森林生态系统(太保山)相比，保山农田生态系统中绿僵菌更占优势地位。太保山森林生态系统中，优势属为虫草属(7种273株)和白僵菌属(5种80株)，绿僵菌的种类和数量都较少(3种11株)[21]。保山农田生态系统中第一优势属为绿僵菌属，其种类和数量(8种，菌株数占总数的64.76%)远超过第二优势属白僵菌属(4种，菌株数占13.32%)和虫草属(5种，菌株数占6.02%)。郭先见等[19]对茶园虫生真菌的研究中，淡紫紫孢菌、球孢白僵菌和金龟子绿僵菌为优势种群。淡紫紫孢菌和球孢白僵菌在保山4种类型农田中也属于优势种，但保山农田生态系统中最占优势的物种是棕色绿僵菌，这可能是不同的地理环境造成的。

4 结 论

保山市4种类型农田生态系统(腾冲火山区的茶园和烟田，潞江坝热作区的咖啡田和玉米田)中虫生真菌菌株数量丰富、物种多样性较高，共获得3科6属20种共计3340株菌株。虫生真菌的分布受地理区域的影响较小，受作物种类和栽培模式的影响较大，虫生真菌的数量和丰富度均为茶园和咖啡田2种多年生作物农田较高，而玉米田和烟田2种1年生作物农田较低。保山农田生态系统中虫生真菌优势种属现象明显，且4种农田中的优势属和优势种比较一致，第一优势属为绿僵菌属(Metarhizium)，第二优势属为白僵菌属(Beauveria)和虫草属(Cordyceps)；第一优势种为棕色绿僵菌(M.brunneum)，第二优势种为保山绿僵菌(M.baoshanense)，其次为淡紫紫孢菌(P.lilacinum)和球孢白僵菌(B.bassiana)。保山4种类型农田生态系统中一年12个月均有虫生真菌的分布，夏季(6—8月)菌株数量最多，春秋季菌株数量较少，冬季菌株数量最少。茶园和咖啡田各月的菌株检出数高于玉米田和烟田；茶园夏季的菌株数量与咖啡田和玉米田差距不大，主要是春秋冬季的菌株数量拉开差距，使其菌株总数为最高(1087株)。