慢性阻塞性肺疾病早期远端肺小动脉重塑及相关NOX4表达水平研究

高 超，郭晓桐，郝斌威，曹 霞，范玉春，陈 娟

（1.宁夏医科大学，银川 750004；2.宁夏回族自治区银川监狱医院，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院呼吸与危重症医学科，银川 750004；4.山西白求恩医院山西医学科学院呼吸与危重症医学科，太原 030000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种慢性进行性气道和肺实质炎症性疾病，逐渐进展形成气流受限和肺泡毛细血管网破坏，肺泡缺氧及肺血管重塑会促进肺血管阻力和肺动脉高压（pulmonary artery hypertension，PAH）升高。远端肺小动脉重塑是肺血管阻力升高及血管扩张性降低的主要因素[1-2]。而肺血管平滑肌细胞的增殖、迁移和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组分的沉积又是COPD肺动脉重塑的重要过程[3]。过多的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）激活氧化还原敏感信号通路，导致血管收缩增强和PAH肺血管重塑[4]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nucleotide phosphate oxidase，NOX）是细胞内ROS产生的重要来源。NOX4是其7个家族成员之一，通过介导血管平滑肌及血管内皮细胞增殖、分化、凋亡等参与血管舒缩性控制及血管生成。低氧通过上调转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）诱导肺动脉平滑肌细胞高表达NOX4，促进细胞内ROS产生，诱导肺血管平滑肌细胞增生，从而参与肺动脉重塑[5]。目前针对轻中度以及未发生PAH的COPD患者的肺小动脉重塑机制研究甚少，本研究旨在观察轻中度COPD（未合并PAH）患者远端肺小动脉重塑情况，并探索TGF-β1介导的NOX4高表达及ECM异常沉积在肺小动脉重塑中的作用及机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象

根据《GOLD指南2018》[6]，选取2018年9月至2020年3月宁夏医科大学总医院收治的需行手术治疗的肺部肿瘤合并COPD（稳定期）患者24例（COPD组），其中轻度15例，中度9例，年龄40～65岁。选取同期需行手术治疗的肺部肿瘤而肺功能正常患者20例（对照组），年龄40～65岁。纳入患者均签署知情同意书。排除标准：①COPD合并肺动脉高压患者；②引起COPD类似症状和肺功能改变的其他疾病患者；③肺静脉闭塞及继发性肺动脉高压的其他肺血管疾病患者。

1.2 研究方法

1.2.1 主要试剂 山羊来源а-SMA抗体、兔多克隆抗体DAPDH（美国Abcam公司），兔来源NOX4抗体（美国Novus公司），鼠抗人Ⅳ型胶原单克隆抗体、兔抗人Ⅰ型胶原单克隆抗体、兔抗人纤维连接蛋白多克隆抗体、鼠抗人层粘连蛋白单克隆抗体、封闭用10%兔血清、封闭用山羊血清、辣根过氧化物酶标记二抗、DAB试剂盒（北京中杉金桥公司），重组人TGF-β1蛋白（美国R＆D公司），封闭用驴血清、RIPA裂解液（北京索莱宝公司），人原代肺动脉平滑肌细胞（human primary pulmonary artery smooth muscle cells，HPASMC）、平滑肌细胞完全培养（美国Sciencell公司），BCA蛋白提取试剂盒（凯基生物公司），辣根过氧化物酶标记荧光二抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）/HRP抗体、辣根过氧化物酶标记驴抗山羊IgG（H+L）/HRP抗体（美国Proteintech公司）。

1.2.2 人体组织收集及处理 收集受试者肿瘤病灶远端（＞5 cm）、正常、新鲜的肺组织，约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小。石蜡包埋组织制成3 μm厚切片；新鲜组织用于检测目的蛋白表达，HE染色观察肺组织病理改变。使用а-平滑肌肌动蛋白抗体（а-smooth muscle actin，а-SMA）标记肺动脉平滑肌细胞，在此基础上每张切片高倍视野（×400）随机选取3～5个结构完整的肺小动脉（血管横断面外径为100～500 μm）为观察对象[7]，采用Image-Pro Plus software 6.0（IPP）图像分析软件测量血管平滑肌层厚度（wall thickness，WT）、血管外径（external diameter，ED）、血管平滑肌层面积（vascular wall area，WA）、血管总面积，计算平滑肌层厚度占血管外径的百分比（WT%）[8]和平滑肌层面积占血管总面积的百分比（WA%）[9]。

1.2.3 免疫组织化学法测定肺组织远端肺小动脉平滑肌细胞а-SMA、Ⅳ型胶原蛋白（CollagenⅣ）、Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）、纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、粘连蛋白（laminin，LN）及NOX4蛋白表达情况 术中获取受试者肺组织后常规固定、石蜡包埋，制成3 μm厚石蜡切片。常规烤片、脱蜡、柠檬酸盐高压修复，3%H2O2消除内源性过氧化物，血清（10%兔血清，进口山羊血清）封闭，一抗孵育（兔来源NOX4抗体，1∶200稀释；山羊来源а-SMA抗体，1∶200稀释；鼠抗人CollagenⅣ抗体、兔抗人Collagen I抗体、兔抗人FN抗体、鼠抗人LN抗体，1∶200稀释）4℃过夜。滴加辣根过氧化物酶标记的相应二抗37℃孵育30 min。DAB显色，苏木素复染，脱水、封片。以PBS代替一抗做阴性对照。结果判读：平滑肌细胞胞浆内见棕黄色颗粒视为阳性，未见表达为阴性。采用IPP图像分析软件分析目的蛋白阳性细胞的平均光密度（average optical density，AOD）[10]，AOD=积分光密度/染色区域分布面积。

1.2.4 细胞培养及处理 将HPASMC置于平滑肌细胞完全培养基中培养（37℃、5% CO2加湿空气）。通过а-SMA免疫细胞化学及免疫细胞荧光化学法检测鉴定HPASMC，第2～8代HPASMC用于实验。取对数生长期的HPASMC制成细胞悬液，接种于24孔板中，分为TGF-β1刺激与未刺激组，每组4个副孔。TGF-β1组使用加新鲜培养基配制的TGF-β1蛋白（2 ng·mL-1）刺激HPASMC 24 h后收集细胞，TGF-β1蛋白使用浓度以及作用时间参考本课题组前期研究[11]；对照组在相同的培养条件下加入PBS液培养24 h后收集细胞。

1.2.5 免疫细胞化学法（ICC-P）与免疫细胞荧光法（IFC-P）测定HPASMC的а-SMA、NOX4及CollagenⅠ蛋白表达情况4%多聚甲醛固定HPASMC，0.5%Triton X-100通透，5%驴血清封闭，目的一抗（а-SMA抗体1∶100、NOX4抗体1∶200、CollagenⅠ抗体1∶200）4℃过夜孵育。次日加入一抗相应二抗或荧光二抗孵育，免疫细胞化学加入DAB工作液显色，免疫细胞荧光化学加入DAPI染核，倒置显微镜及倒置荧光显微镜下观察上述目的蛋白表达情况。结果判读：免疫细胞化学阳性信号为细胞胞浆内见棕黄色颗粒视为阳性，未见表达为阴性。免疫细胞荧光化学：а-SMA以细胞浆内呈现红色荧光为阳性反应，NOX4以细胞浆内呈现绿色荧光为阳性反应，DAPI为细胞核呈现蓝色荧光。采用IPP图像分析软件分析目的蛋白阳性细胞的AOD值。

1.2.6 蛋白免疫印迹法（Western blot）测定受试者肺组织以及HPASMC的а-SMA、NOX4、Collagen I蛋白表达情况 对于肺组织，术中获取受试者新鲜肺组织后迅速置入液氮中快速冷冻，将1.0 mL冰冻的RIPA裂解液加入大约300 μg的肺组织中进行匀浆；对于HPASMC，第2～8代HPASMC在冰上收获，用RIPA裂解液提取蛋白质。根据蛋白提取试剂盒及BCA法提取并测定肺组织及HPASMC的蛋白浓度。10% SDS-PAGE转移电泳，转膜、封闭，目的一抗（山羊抗人а-SMA抗体1∶2 000；NOX4抗体1∶1 000；兔抗人Collagen I抗体1∶500；兔抗人GAPDH抗体1∶2 000）4℃孵育过夜。使用辣根过氧化物酶标记的二抗［山羊抗兔IgG（H+L）/HRP抗体，稀释1∶5 000；驴抗山羊IgG（H+L）/HRP抗体，稀释1∶5 000］室温孵育1 h。GAPDH作为内参。ChemiDoc MPTMImaging System分析系统曝光、扫描。应用IPP软件通过光密度测定法量化目的蛋白表达AOD值。

1.3 统计学方法

数据应用SPSS 19.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两样本间均数比较采用独立样本t检验；计数资料（性别）比较采用卡方检验；各指标的相关性分析采用Pearson相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般临床资料比较

两组患者在性别、年龄、吸烟指数（吸烟指数=每日吸烟包数×吸烟年数）方面差异均无统计学意义（P均＞0.05）。COPD组患者第一秒用力呼气容积/用力肺活量（forced expiratory volume in one second/forced vital capacity，FEV1/FVC）、第一秒用力呼气容积占预计值百分比（forced expiratory volume in one second total predicted value，FEV1%pred）及动脉血氧分压（arterial partial pressure of oxygen，PO2）均低于对照组（P均＜0.05）。COPD组动脉血二氧化碳分压（partial pressure of carbon dioxide，PCO2）高于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 两组患者一般临床资料比较

2.2 两组患者肺组织形态改变

HE染色结果显示：COPD组患者肺泡形态不规则，肺泡部分融合呈气肿样改变，肺泡间隔及小气道壁增厚并可见不同程度炎性细胞浸润。COPD组患者远端肺小动脉平滑肌层增厚，血管腔变形且管腔缩小，血管管壁及周围不同程度炎性细胞浸润，图1。

图1 两组患者肺组织形态改变（HE×200）

使用а-SMA标记肺小动脉平滑肌细胞结果显示，肺小动脉ED在COPD组与对照组差异无统计学意义（P=0.320），COPD组患者肺小动脉WT、WT%、WA%均较对照组增高（P均＜0.05），见图2、表2。

表2 两组患者肺小动脉重塑指标比较（±s）

表2 两组患者肺小动脉重塑指标比较（±s）

?

图2 两组患者肺小动脉平滑肌а-SMA表达情况（IHC×400）

2.3 两组患者远端肺小动脉ECM蛋白表达情况

免疫组织化学染色发现，ECM蛋白（CollagenⅠ、CollagenⅣ、LN、FN）在肺小动脉平滑肌细胞胞质中均有表达；COPD组肺小动脉平滑肌CollagenⅠ、CollagenⅣ、LN、FN AOD值均较对照组增强（P均＜0.05），见图3、表3。

表3 两组患者远端肺小动脉ECM蛋白表达水平（AOD值）比较（±s）

表3 两组患者远端肺小动脉ECM蛋白表达水平（AOD值）比较（±s）

?

图3 两组患者肺小动脉ECM蛋白表达情况（IHC×400）

2.4 两组患者远端肺小动脉平滑肌细胞а-SMA、NOX4蛋白表达情况

免疫组织化学染色发现，а-SMA、NOX4在肺小动脉平滑肌细胞胞质中均有表达；COPD组肺小动脉平滑肌а-SMA、NOX4表达AOD值［（1.23±0.80）、（0.94±0.54）］均较对照组［（0.09±0.06）、（0.02±0.01）］增强（P均＜0.05）。Western blot结果显示，COPD组肺组织а-SMA、NOX4蛋白表达灰度值［（1.46±1.12）、（1.65±1.20）］较对照组［（0.85±0.58）、（0.62±0.28）］增强（P均＜0.05），见图4、图5。

图4 两组患者肺小动脉NOX4蛋白表达情况（IHC×400）

图5 Western blot检测两组患者肺组织а-SMA、NOX4蛋白表达的电泳图

2.5 TGF-β1作用于HPASMC 24 h后NOX4、а-SMA、CollagenⅠ蛋白表达情况

ICC-P及IFC-P检测TGF-β1（2 ng·mL-1）作用于HPASMC 24 h后，NOX4、а-SMA、CollagenⅠ蛋白表达AOD值均较TGF-β1未作用前增高（P均＜0.05），见图6、图7、表4。

表4 TGF-β1作用于HPASMC前和24 h后NOX4、а-SMA、CollagenⅠ蛋白表达水平比较

图6 TGF-β1（2 ng·mL-1）作用于HPASMC 24 h后NOX4、а-SMA、CollagenⅠ蛋白表达情况（ICC-P×400）

图7 TGF-β1（2 ng·mL-1）作用于HPASMC 24 h后NOX4、а-SMA、CollagenⅠ蛋白表达情况（IFC-P×400）

2.6 各指标的相关性分析

肺动脉重塑指标WA%、WT%与FEV1/FVC、FEV1%pred均呈负相关（P均＜0.05）。肺小动脉平滑肌细胞CollagenⅠ、CollagenⅣ、LN、FN蛋白AOD值与FEV1/FVC、FEV1%pred均呈负相关（P均＜0.05），见表5。

表5 各参数间的相关性分析结果

3 讨论

COPD不仅是一种气道疾病，而且同多数慢性弥漫性肺部疾病一样，肺微血管和毛细血管前小动脉也会受到影响[12]。肺动脉重塑导致PAH是COPD的特征性表现，ECM沉积、血管平滑肌细胞增殖和肥大均参与其中，导致毛细血管前肺动脉闭塞和PAH持续升高[13-14]。然而，肺动脉重塑并非只存在于晚期COPD，在没有动脉低氧血症的轻中度COPD患者中也发现了肺动脉重塑现象[15]，主要表现为内膜增厚、血管壁面积增加以及中层血管壁增厚[16]。氧疗常常不能逆转COPD患者的PAH，且轻度COPD患者通常不存在低氧，这表明此类COPD患者的肺血管重塑包括不能用低氧性血管收缩来解释的其他因素。目前针对未发生PAH的COPD患者肺血管重塑机制研究甚少，本研究选取未发生PAH的轻至中度COPD患者为研究对象，使用平滑肌标记性抗体а-SMA标记远端肺小动脉（血管横断面外径100～500 μm），发现未发生PAH的COPD组患者的肺小动脉WT、WT%、WA%均较对照组增高，且肺小动脉а-SMA表达较对照组增高，提示未发生PAH的COPD患者存在以平滑肌层增厚、面积增大为表现的远端肺小动脉重塑。相关性分析也显示，肺动脉重塑指标WA%、WT%与FEV1/FVC、FEV1%pred均呈负相关，提示肺小动脉重塑与气流阻塞程度相关。

ECM是由高度交联的分泌蛋白组成的复杂网络，其主要结构成分被称为“核心基质”。ECM的重构对伤口愈合和组织内稳态至关重要，这一过程失调会导致多种病理状态，包括COPD发生[17]。ECM沉积、肺动脉平滑肌细胞的增殖和肥大，促进肺动脉中膜肥大和肌化，导致毛细血管前肺动脉闭塞和PAH持续升高[13，18]。本研究采用免疫组织化学检测法观察人远端肺小动脉ECM沉积情况，结果显示COPD组患者肺小动脉ECM蛋白（CollagenⅠ、CollagenⅣ、LN、FN）表达较对照组增强，提示ECM沉积参与COPD远端肺小动脉重塑。相关性分析显示远端肺小动脉ECM蛋白表达与FEV1/FVC、FEV1% pred均呈负相关，提示肺小动脉ECM沉积也与气流阻塞程度相关。

ROS是公认的引起血管壁细胞增殖和血管收缩的刺激因素。在COPD中，ROS从活化的炎性细胞或结构细胞如上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞中释放出来，直接损害细胞成分。研究[19-20]显示，ROS参与肺动脉平滑肌细胞的增殖和EMC的沉积。NOX是脉管系统中产生ROS的重要来源，低氧诱导的NOX的激活在PAH中起重要作用，NOX促进肺血管收缩和血管重塑[21-22]。NOX4是NOX家族成员之一，作为PASMCs中主要的NOX亚型，NOX4通过介导肺动脉平滑肌增生、内皮细胞迁移增殖、分化及凋亡等，参与血管舒缩、血管生成以及PAH的发生[23]。TGF-β1是一种非活性的潜伏前体，从细胞分泌出来后与潜伏期TGF-β1结合蛋白（latent TGF-β1 binding protein，LTBP）结合，LTBP引导潜伏期复合物定位于ECM[24]。PAH患者的肺小动脉PASMC显示出较高水平的TGF-β1细胞内活性，PAH内分泌TGF-β1途径通过介导表皮生长因子和血小板源性生长因子诱导ECM沉积和PASMC细胞增殖[25]。

本课题组前期研究[11]显示：COPD组患者肺组织远端肺小动脉平滑肌细胞TGF-β1蛋白表达较对照组增高，提示TGF-β1参与COPD远端肺小动脉重塑。本研究发现COPD组患者肺小动脉平滑肌及肺组织NOX4表达均高于对照组，且采用TGF-β1能够刺激诱导HPASMC分化并上调HPASMC细胞NOX4、а-SMA及CollagenⅠ表达增强。因此，推测TGF-β1可能通过上调NOX4导致ROS产生增多，并通过此机制促进细胞转分化及ECM蛋白的分泌，NOX4/TGF-β1相关氧化应激信号通路可能参与了ECM介导的COPD肺小动脉重塑。

综上，COPD患者存在以平滑肌层增厚以及细胞外基质沉积为主的肺小动脉重塑，TGF-β1介导的NOX4相关氧化应激信号通路可能参与了COPD肺小动脉重塑的发生。