不同调制方式对烟叶和烟梗TSNAs形成和积累的影响

张晶云，赵园园，刘德水，程玉渊，周 骏，冯雨晴，吴 疆，史宏志*

（1.河南农业大学 烟草学院/烟草农业减害研究中心，河南 郑州 450002；2.上海烟草集团有限公司 技术中心 北京工作站，北京 101121；3.河南省烟草公司 南阳市公司，河南 南阳 473000）

硝酸盐和生物碱是烟草特有强致癌物质亚硝胺(TSNAs)的前体物，烟草特有亚硝胺主要包括4种：N′-亚硝基去甲基烟碱(NNN)、4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟草碱(NAT)［1］。一般认为，TSNAs在进入调制前的鲜烟叶中是不存在的［2］，其形成和积累主要发生在调制和贮藏过程中。Burton等［3-4］对白肋烟研究时发现，TSNAs的大量积累发生在烟叶变黄末期，在烟叶进入调制过程后，随着烟叶水分的散失、细胞膜透性的增加、细胞内物质的外流，微生物迅速繁殖，酶活性增强，烟叶中的硝酸盐被还原生成亚硝酸盐，进一步与生物碱反应生成TSNAs［5-6］，这是白肋烟调制过程中TSNAs形成的主要原因。调制结束后的贮藏阶段亦是TSNAs形成的重要时期，经过贮藏阶段的白肋烟烟叶，其TSNAs含量与调制结束时相比可增加50%以上［7-8］。众多研究表明［9-10］，在烟叶贮藏过程中，高硝酸盐含量、高温条件与TSNAs的形成密切相关，其中，在高温条件下，硝酸盐产生了大量的气态氮氧化物，进而与生物碱发生亚硝化反应生成TSNAs，硝酸盐含量高的主脉更有利于TSNAs的形成。

烟梗是烟叶的有机组成部分，也是卷烟生产中不可或缺的原料之一，烤烟的含梗率为25% ～35%，由于其具有填充值高、焦油释放量低的优点，在降低卷烟焦油含量和原料成本方面具有独特的作用［11］。烟叶叶片和主脉在化学成分上存在很大差异，白肋烟叶片中的生物碱和蛋白质含量高于主脉，而钾、氯含量则低于主脉［12］；烤烟叶片中的NH4-N、NO2-N、总氮和可溶性蛋白含量显著高于主脉，而主脉中的NO3-N和TSNAs含量显著高于叶片［13-14］。李亚飞等［15-17］比较不同类型烟叶的化学成分差异后得出，白肋烟烟叶总氮、硝酸盐含量明显较烤烟高，而糖类物质低于烤烟，这种差异在苗期已存在，调制后的白肋烟烟叶硝酸盐含量较烤烟高几十甚至上百倍。不同调制方式的调制环境和时间，其微生物活性和气态氮氧化物的产生都存在显著差异，进而对TSNAs的形成产生了不同的影响。李宗平等［18］研究表明，晾制烟叶中的特有亚硝胺含量最高，其次是晒制的，烤制的最低。郑昕等［19］对晒烟品种万毛9号的试验表明，晾制条件下的TSNAs含量高于晒制的。

目前，有关烤烟在烘烤过程中TSNAs的相关研究多集中在如何降低TSNAs含量方面，如宫长荣等［20］研究发现，在烤烟调制初期和变黄过程中使用频率为2450 MHz的微波处理能降低TSNAs的含量。潘建斌等［21］通过改变烘烤过程中变黄温度和变黄时间以降低TSNAs含量。而有关烤烟在不同调制方式下TSNAs含量的差异以及叶片和主脉不同阶段TSNAs含量变化方面的研究较少，烤烟主脉和叶片TSNAs的形成机理尚不清楚。为此，本试验采用烤烟品种云烟87为材料，设置正常烘烤、晾制和先烤后晾3种调制方式，探讨了烤烟在不同调制环境中不同阶段的烟叶叶片和主脉TSNAs及其前体物含量的变化特点，以明确不同调制方式对烤烟TSNAs形成和积累的影响，初步探究了烤烟烘烤过程中TSNAs的形成机理，为今后降低烤烟TSNAs含量提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验地点

试验时间为2019和2020年，试验地点设在河南省南阳市方城县清河镇金叶园，供试材料为当地主栽烤烟品种云烟87的上部6片叶。施肥方式为当地习惯施肥，施氮量为45 kg/hm2，供试肥料包括烟草专用复合肥(N-P-K=10-10-20)、硝酸钾、硫酸钾、液态钾肥、芝麻饼肥、沼渣有机肥。田间管理按照当地优质烟叶生产技术规范进行。

1.2 试验设计

对不同调制方式设置3个处理：正常烘烤、晾制、先烤后晾。正常烘烤：在当地专用烤房内进行，其中，变黄阶段的干、湿球温度分别控制在35～42 ℃、33～37 ℃之间，时间48～72 h；干叶阶段的干、湿球温度分别控制在45～54 ℃、37～39 ℃之间，时间36～48 h；干筋阶段的干、湿球温度分别控制在55～68 ℃、40～43 ℃之间，时间24～36 h；烘烤时间合计120～144 h。晾制：在自然条件下的晾架内进行，晾制时间保持在25～35 d之间，其中凋萎期的空气相对湿度保持在70%～80%之间，持续3～4 d；变黄期的空气相对湿度保持在70%～75%之间，持续10～15 d；干叶期的空气相对湿度保持在60%～65%之间，持续6～7 d；干筋期的空气相对湿度保持在60%以下，持续6～7 d。先烤后晾：首先进行正常烘烤，烤至干叶期后进行晾制，时间大约为11 d，具体工艺流程和技术操作分别按烤烟烘烤技术规程［22］和雪茄茄芯晾制技术规程［23］进行。各处理分别于调制前、变黄末、干叶后、干筋后取样，杀青或烘干后粉碎，磨样，过0.25 mm筛子，待测。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 硝酸盐含量的测定烟叶和主脉的NO3-N含量采用浓H2SO4-水杨酸法测定［24］。

1.3.2 生物碱含量的测定准确称取200 mg烟末置于15 mL试管中，加入内标溶液100 µL、10% NaOH溶液1.5 mL、甲基叔丁基醚(MTBE)3 mL，旋紧旋盖，充分振荡5 min后，室温放置过夜(24±2) h，取上层清液进行气相色谱法(GC)分析。每个样品应平行测定2次。原理：在碱性条件下，利用甲基叔丁基醚等有机溶剂提取烟草或烟草制品中的生物碱类物质，通过气相色谱—氢火焰离子化检测器(GC-FID)定量分析4种生物碱的含量。

1.3.3 TSNAs含量的测定样品均由上海烟草集团北京卷烟厂测定，测定方法：在线SPE-液相色谱质谱联用(SPE-LC-MS/MS)法［SPE-LC：Spark Holland, Symbiosis (Pico)；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500］。称取1.0 g烟样，将其放入50 mL锥形瓶中，加入40 μL 4种氘代TSNAs(内标)溶液(5000 ng/mL)和30 mL 100 mmol/L乙酸铵水溶液，在室温下用振荡器(200 r/min)萃取60 min，萃取液过0.45 μm水相滤膜后，采用LC-MS/MS法测定烟叶的NNN、NNK、NAT和NAB含量，其含量之和为TSNAs总量。2020年样品NAB的含量极低，均未被检测到。

1.4 数据处理

采用Excel 2019软件制表绘图，采用DPS 7.05软件进行方差分析，显著性检验用F检验法，多重比较采用LSD法。

2 结果与分析

2.1 不同调制方式对TSNAs形成和积累的影响

2.1.1 正常烘烤条件下TSNAs的形成和积累动态变化由图1可知，2019年在正常烘烤条件下，叶片中各TSNAs及其总量随着烘烤进程的推进而呈逐渐增加的趋势，且各个时期间均存在显著差异，在干筋阶段TSNAs含量增加最多，增加量为78.13 ng/g；主脉中TSNAs含量低于叶片，在烘烤过程中TSNAs含量逐渐增加，变黄期、干叶期和干筋期分别增加了34.08、35.70和41.21 ng/g。

图1 烤烟正常烘烤条件下TSNAs的形成和积累动态变化

2020年烤烟正常烘烤过程中叶片NNN、NAT、NNK、TSNAs总量不断增加，且以干筋阶段增加较多，为73.90 ng/g；主脉中各TSNAs的含量也随着烘烤进程的推进而呈现出逐渐增加的趋势，但其含量整体低于叶片，TSNAs总量在干筋阶段的增加量最大，为46.88 ng/g。

2.1.2 烤烟晾制条件下TSNAs的形成和积累动态变化由图2可知，2019年在晾制条件下，各阶段的叶片TSNAs含量均随着晾制过程的推进而逐渐增加，且以变黄期增加较多，TSNAs总量增加了38.10 ng/g；干筋后的叶片TSNAs含量低于2019年正常烘烤干筋后的含量；晾制前鲜烟叶中主脉TSNAs含量低于叶片，但随着晾制过程的推进，主脉TSNAs含量逐步增加，在变黄阶段即表现出高于叶片的趋势，变黄期TSNAs总量增加了186.11 ng/g，增加量是叶片的4.88倍，干筋后TSNAs总量是叶片的2.41倍。

图2 烤烟晾制条件下TSNAs的形成和积累动态变化

2020年在晾制条件下，各阶段的叶片TSNAs含量均随着晾制过程的推进而持续增加，在烟叶变黄阶段增加量较多，TSNAs总量增加了45.16 ng/g，干筋后叶片TSNAs总量相较于2020年正常烘烤干筋后的少了82.09 ng/g；主脉TSNAs含量自进入晾制条件后逐步增加，且在变黄期及变黄之后显著高于叶片，大幅度增加主要发生在变黄阶段，TSNAs总量的增加量是同时期叶片的3.83倍，而在变黄期之后增加量急剧下降。

2.1.3 烤烟先烤后晾条件下TSNAs的形成和积累动态变化由图3可知，2019年叶片中各TSNAs含量及其总量总体上随着调制过程的推进而逐渐增加，且在烘烤变黄阶段的增加量较高，为56.44 ng/g，烟叶自干叶进入晾制条件后，叶片的NNN、NAT、TSNAs总量增加不显著，干筋后叶片TSNAs总量相比于正常烘烤干筋后的少了82.33 ng/g。主脉中TSNAs含量略低于叶片，但主脉TSNAs含量随着调制过程的推进也呈现逐渐增加的趋势，尤其以变黄阶段的增加量最高，为47.08 ng/g，与叶片TSNAs总量在干筋期增加不显著表现不一致的是，主脉在进入晾制条件后的干筋阶段仍在增加，但其增加量比变黄阶段的少。

图3 烤烟先烤后晾条件下TSNAs的形成和积累动态变化

2020年叶片中各TSNAs含量及其总量在烘烤条件下随着烘烤过程的推进而逐渐增加，大量增加的情况发生在变黄期，其中TSNAs总量增加了60.12 ng/g，而进入晾制条件后NNK和TSNAs总量增加不显著，主脉中TSNAs含量的变化规律与叶片的表现基本一致，在变黄期TSNAs总量增加较多，为60.67 ng/g，各阶段主脉TSNAs含量略低于叶片。先烤后晾调制结束后烟叶叶片和主脉的TSNAs总量均低于正常烘烤干筋后叶片和主脉的TSNAs总量。

2.2 调制方式对不同调制阶段TSNAs积累比例的影响

2.2.1 不同调制方式下叶片TSNAs的积累比例由表1可知，在正常烘烤条件下，叶片TSNAs含量在变黄期、干叶期和干筋期3个阶段的增加量逐渐升高，TSNAs总量在干筋期的增加量最高，而增加幅度则在变黄期最高。在晾制条件下，叶片中TSNAs总量的增加量及幅度均随着晾制过程的推进而呈现逐渐降低的趋势，TSNAs总量在变黄期的增加量及幅度最高，干筋阶段则最小。在先烤后晾条件下，叶片中TSNAs总量在变黄期的增加量及幅度最高，而在干叶期则呈现降低的趋势，烘烤结束进入晾制阶段后TSNAs总量几乎不增加，NNN、NAB、NNK在干筋期甚至有下降的趋势。

表1 不同调制方式下叶片TSNAs的积累比例

2.2.2 不同调制方式下主脉TSNAs的积累比例由表2可知，在正常烘烤条件下，主脉中TSNAs增加量在正常烘烤条件下3个阶段均呈现升高的趋势，TSNAs总量在干筋阶段增加最多，而增加幅度则呈现逐渐下降的趋势。在晾制条件下，主脉TSNAs增加量及幅度逐渐降低，在变黄期的增加量及幅度分别是正常烘烤的5.54、5.47倍，且远高于同阶段叶片的增加量及幅度。在先烤后晾条件下，主脉中TSNAs在变黄期增加量及幅度较高，在烘烤结束进入晾制阶段的干筋期则较低。

表2 不同调制方式下主脉TSNAs的积累比例

2.3 烤烟叶片和烟梗烟草特有亚硝胺前体物的差异性分析

烤烟叶片和主脉在进入调制前的杀青样中TSNAs的前体物（生物碱和硝酸盐）含量如表3所示，2019年烟叶叶片中生物碱含量显著高于主脉，生物碱总量是主脉的3.38倍；主脉硝酸盐含量显著高于叶片，是叶片的3.84倍。2020年烟叶叶片和主脉的生物碱和硝酸盐含量差异与2019年表现一致，即叶片生物碱含量显著高于主脉，总生物碱含量是主脉的3.51倍；主脉中硝酸盐含量显著高于叶片，是叶片的3.24倍。

表3 烤烟调制前叶片和烟梗中特有亚硝胺前体物含量的比较

3 讨论

TSNAs是烟草生物碱与亚硝酸发生亚硝化反应生成并存在于烟叶和烟气中的有害成分，在鲜烟叶中几乎不存在，主要形成于调制和贮藏过程中。在白肋烟调制过程中，TSNAs的形成主要是由于常温条件有利于微生物活动，促使硝酸盐在硝酸盐还原酶作用下还原成亚硝酸盐，进而与生物碱发生反应而产生TSNAs，有研究认为［25］，明火调制过程中产生的气态氮氧化物与烤烟TSNAs的形成密切相关。本研究表明，在正常烘烤条件下，烤烟前期TSNAs的增加量少，主要是由于烘烤过程短，烟叶失水快，高温下大部分微生物活性较低［26］，不利于硝酸盐在微生物作用下被硝酸还原酶还原生成亚硝酸，而生物碱对TSNAs形成的贡献相对较大，由于叶片生物碱含量高于主脉，因而叶片的TSNAs含量高于主脉。叶片和主脉的TSNAs含量均在干筋期增加较多，这是由于硝酸盐具有化学不稳定性，叶片和主脉中的硝酸盐在干筋期的高温条件下产生了大量的气态氮氧化物，进而促进了TSNAs的形成，由于主脉中硝酸盐含量显著高于叶片，导致干筋期主脉TSNAs含量的增加幅度更高。在晾制条件下，叶片和主脉TSNAs在变黄期增加量及幅度较高，这与温度和变黄时间有关，相比于正常烘烤，晾制时的温度低和变黄时间长，有利于微生物活动，促进了硝酸盐还原为亚硝酸盐，进一步与生物碱反应生成TSNAs，这与潘建斌等［21］的研究结果一致。烤烟在晾制条件下，温度低，失水慢，微生物活性较强，TSNAs含量明显升高，加之主脉硝酸盐含量显著高于叶片，造成主脉的TSNAs在变黄期大量积累；干叶期和干筋期微生物活性逐渐减弱，烟叶水分逐渐散失，且在晾制条件下，温度相对较低，不利于硝酸盐产生氮氧化物，因此调制后期TSNAs生成较少。烤烟先烤后晾条件下，调制结束后的叶片和主脉TSNAs总量均低于正常烘烤，主要是由于进入晾制条件后的干筋阶段，叶片和主脉TSNAs总量的增加量及幅度均显著低于正常烘烤，前期正常烘烤温度高，微生物活性弱，不利于TSNAs总量的生成，干叶后进入晾制条件烟叶水分大量减少，且温度较低，不利于硝态氮产生氮氧化物，因而在变黄期和干筋期TSNAs的形成均较少。

TSNAs的形成始于调制阶段，因此选用适当的调制方式，控制调制过程中的反应条件对降低烤烟TSNAs含量是非常重要的。改变传统的明火调制方式，采用热交换式烤房，能减少氮氧化物与烟叶生物碱的反应，这是降低烤烟TSNAs含量的有效方式［27］。除了调制设备外，调制过程中的温度、湿度、微生物等都会影响TSNAs的生成，烤烟烘烤过程中处于较高的温度条件下，微生物活性弱，主要是高温条件致使硝酸盐产生的大量气态氮氧化物与生物碱反应形成TSNAs，因此干筋期是烤烟TSNAs形成和积累的关键时期，通过控制烘烤后期环境、农业和生物措施来降低烟叶和烟梗硝酸盐含量是降低烤烟TSNAs含量的有效途径之一。

4 结论

烤烟在正常烘烤时，叶片的TSNAs含量高于主脉，在干筋期的增加量较大，这可能与高温低湿条件下硝态氮生成气态氮氧化物有关；在晾制条件下，整体上主脉的TSNAs含量显著高于叶片，变黄期TSNAs的形成和积累显著高于烤制烟叶，干筋期则低于烤制烟叶；在先烤后晾条件下，叶片的TSNAs含量高于主脉，变黄期的TSNAs含量低于晾制烟叶，干筋期的TSNAs含量低于正常烘烤烟叶。因此，干筋期是降低烤烟TSNAs形成的关键时期。