盐酸异丙嗪注射液细菌内毒素检查方法可行性研究

王 恺，苏健

(江苏省南通市食品药品监督检验中心，南通 226006)

盐酸异丙嗪为吩噻嗪类抗组胺药，临床主要用于抗过敏和止吐，也可用于治疗一些晕动病，包括镇静、催眠、镇痛等[1]。《中国药典》2015 版二部[2]收录了该品种，标准中细菌内毒素检查项下规定每1 mg 盐酸异丙嗪中含内毒素的量应＜3.0 EU，按《中国药典》2015 年版四部1145 细菌内毒素检查法的常规方法，在实际检验工作中发现盐酸异丙嗪注射液对细菌内毒素检查存在严重干扰，实验中的供试品阳性对照管不凝，导致试验无效，给临床用药带来安全隐患。本文通过反复分析，多次试验，有效消除了盐酸异丙嗪注射液细菌内毒素检查的实验干扰。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 ZH-2 BLENDER 自动漩涡混合器(天津药典标准仪器厂)，MM-2 快速旋涡振荡器(江苏沈高康健升华器具厂)，ET-96 内毒素凝胶法测定仪(天津市天大天发科技有限公司)，DHG-9620A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，经250 ℃30 min 处理的玻璃仪器，微量移液枪和无热原枪头。药品：盐酸异丙嗪注射液(规格2 mL：50 mg，批号：2008171,20085126,20081591,21010811,20111215,广东南国药业有限公司)。鲎试剂：(1)湛江博康海洋生物有限公司，批号：1906033，规格：0.1 mL，灵敏度：0.03 EU·mL-1；(2)湛江安度斯生物有限公司，批号：1908123，规格：0.1 mL，灵敏度：0.03 EU·mL-1；(3)湛江安度斯生物有限公司，批号：2005153，规格：0.1 mL，灵敏度：0.06 EU·mL-1。镁离子缓冲液：批号：1901310，规格：4 mL/支，湛江安度斯生物有限公司；(4)湛江安度斯生物有限公司，批号：2005302，规格：0.1 mL，灵敏度：0.125 EU·mL-1；(5)湛江安度斯生物有限公司，批号：2005241，规格：0.1 mL，灵敏度:0.25 EU·mL-1；(6)湛江安度斯生物有限公司，批号：2005261，规格：0.1 mL，灵敏度：0.5 EU·mL-1。

细菌内毒素工作标准品：中国食品药品检定研究院，批号：150601-201885，规格：80 EU/支。细菌内毒素检查用水：湛江安度斯生物有限公司，批号：1903120，规格：5 mL/支。

1.2 方法

1.2.1 常规方法系列稀释倍数的干扰实验 将盐酸异丙嗪注射液按最大有效稀释倍数(maximum valid dilute double,MVD)150、300、600、1 200、2 400，用细菌内毒素检查用水稀释[3]，制备成系列浓度，并用系列溶液将细菌内毒素工作标准品配制成2 λ、λ、0.5 λ、0.25 λ 浓度的系列细菌内毒素溶液(共20 份细菌内毒素浓度)，并与灵敏度为0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU·mL-1的鲎试剂进行反应，每个浓度实验重复4 管，同时做供试品稀释液和细菌内毒素检查用水的阴性对照，按《中国药典》2015 年版四部1145细菌内毒素检查法供试品干扰试验方法进行实验。

1.2.2 新方法供试品稀释液干扰预实验 使用鲎试剂灵敏度为0.03 EU·mL-1，用补充适量镁离子缓冲液的细菌内毒素检查用水作为供试品稀释剂[4]，依据公式MVC=λ/L，式中：MVC，最低有效稀释浓度(minimum valid concentration)；L，供试品的细菌内毒素限值。MVC 为0.01 mg·mL-1，分别在此浓度前后各增加3 个稀释级，稀释后的系列浓度进行干扰试验，浓度分别为0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25 mg·mL-1，此系列浓度溶液标记为供试品阴性对照(negative product control,NPC)，并制备该系列浓度的细菌内毒素2λ 供试品阳性溶液，记为供试品阳性对照(positive product control,PPC)，使用两个不同厂家灵敏度为0.03 EU·mL-1的鲎试剂，分别加入0.1 mL 细菌内毒素检查用水溶解混匀，再与0.1 mL的各稀释级NPC 和PPC 溶液混匀，同时做阳性对照(positive control,PC)和阴性对照(negative control,NPC)各2 管，37 ℃60 min 后观察[5]。

1.2.3 正式干扰试验 使用两个不同厂家的鲎试剂，灵敏度为0.03 EU·mL-1，用补充适量镁离子缓冲液的细菌内毒素检查用水作为供试品稀释剂，将盐酸异丙嗪注射液稀释成0.01 mg·mL-1供试品溶液，同时用此供试品溶液作NPC，以细菌内毒素检查用水作NC，进行干扰试验，通过供试品3 个批号与2个不同厂家的鲎试剂反应，结果表明Et 值均在0.5～2.0 Es 范围内，认为此浓度的供试品溶液符合干扰试验要求[6]。

2 结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核检验 按《中国药典》2015年版四部1145 细菌内毒素检查法，分别对上述6 批鲎试剂进行灵敏度复核,用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品稀释为对应鲎试剂灵敏度标示值的2.0、1.0、0.5、0.25 λ 系列浓度后进行试验。试验后各批鲎试剂灵敏度测定值λc 均在0.5～2.0 λ 的范围内，“+”为凝固，“-”为未凝固，结果表明该6 批鲎试剂均符合《中国药典》2015 年版四部1145 细菌内毒素检查法的要求，见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核检验结果

2.2 盐酸异丙嗪注射液的MVD 确定 依据公式MVD=cL/λ，式中：c，供试品的浓度；λ，鲎试剂灵敏度。《中国药典》2015 版二部中细菌内毒素检查项规定每1 mg 盐酸异丙嗪中含内毒素的量应＜3.0 EU(即L=3.0 EU·mg-1)，目前鲎试剂灵敏度有0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU·mL-1，其MVD 对应为150、300、600、1 200、2 400。

2.3 常规方法系列稀释倍数的干扰实验结果 供试品系列稀释倍数溶液干扰试验结果表明：NPC 和PPC 均为阴性，系列试验管中鲎试剂与对应反应溶液均未凝固，供试品的Et 值均不在0.5～2.0 Es 范围内，不符合鲎试剂灵敏度的复核试验要求，认为供试品系列稀释倍数浓度下的供试品溶液均存在较强的干扰作用，需要通过其他适宜的方法排除干扰，避免发生假阴性结果。

2.4 新方法供试品稀释液干扰预实验结果 从表2可见，盐酸异丙嗪注射液用补充适量的镁离子缓冲液的细菌内毒素检查用水稀释供试品浓度≤0.01 mg·mL-1时，对2 个厂家的鲎试剂均无干扰，所以采用浓度为0.01 mg·mL-1的稀释液进行正式干扰试验，见表2。

表2 干扰预实验结果

2.5 正式干扰试验及结果 将3 个不同批号的盐酸异丙嗪注射液稀释为0.01 mg·mL-1的溶液，用此系列供试品稀释液将细菌内毒素稀释为0.06、0.03、0.015、0.007 5 EU·mL-1的系列内毒素溶液，同时与2 个不同厂家、灵敏度为0.03 EU·mL-1的鲎试剂进行反应，结果表明：NPC 和PPC 均为阴性，3 个不同批号的供试品溶液的Et 值均在0.5～2.0 Es 范围内，符合鲎试剂灵敏度的复核试验要求，认为供试品在该浓度下的供试品溶液无干扰作用，可按此方法进行试验。

2.6 供试品细菌内毒素检查 按《中国药典》2015年版四部1145 细菌内毒素检查方法，使用含有适量镁离子缓冲液的细菌内毒素检查用水为稀释剂，将盐酸异丙嗪注射液稀释成0.01 mg·mL-1供试品溶液，灵敏度为0.03 EU·mL-1的鲎试剂，对5 批供试品进行检查，样品对实验均无干扰，重复性良好，实验结果均符合《中国药典》规定的要求。

3 讨 论

由于《中国药典》2015 年版四部1145 细菌内毒素检法的常规方法凝胶法对于个别注射液存在专属性差的缺点，对实验造成一定的干扰，为了降低药品的安全风险,必须对实验干扰的因素进行排查和分析，找到切实可行的该品种的可靠性细菌内毒素检验方法，使该产品现行标准更为严谨，排除严重威胁百姓的用药安全隐患,促进药品生产企业的良性发展，从根源上控制生产企业出厂检验关，从源头保证广大人民群众的用药安全。

采用常规方法干扰试验结果表明，盐酸异丙嗪注射液对系列不同标示灵敏度的鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应有较强干扰作用，镁离子缓冲液是一种辅助剂，含有一定量的二价镁离子，能有效缓冲类枸橼酸盐的螯合反应[7]，保持鲎试剂的正常灵敏度，还具有较强的pH 缓冲作用，有效维持鲎试剂反应时的pH 6.0～8.0。由正式干扰试验可见，采用补充适量镁离子缓冲液的细菌内毒素检查用水为稀释剂，供试品稀释为0.01 mg·mL-1时对2 个厂家的鲎试剂均无干扰作用，实验表明此方法可以作为盐酸异丙嗪细菌内毒素检查项下的法定标准检验方法，望涉及该产品的企业质管部门以此为鉴，确保药品的使用安全。