RNA 结合蛋白THUMPD2 在卵巢癌中的表达及临床意义*

花敏慧，盛楠

(南通大学附属医院妇产科，南通 226001)

卵巢癌是常见8 种癌症之一，也是女性恶性肿瘤患者死亡的第七大原因之一[1]。据统计[2]，全球每年有20 万女性被确诊卵巢癌，而2020 年全球新诊断患者约30 万，死亡患者约20 万。卵巢癌是一组高度异质性的疾病，早期特异性症状很少，相当一部分患者在晚期被诊断。卵巢癌的转移和复发是患者死亡的主要原因，迄今为止还没有令人满意的治疗方法[3]。目前卵巢癌的发生率和死亡率仍在上升，严重影响女性的健康和生存。因此，卵巢癌发生发展机制的研究仍是一项紧迫的任务。RNA 结合蛋白在调控卵巢癌发生发展中发挥重要的作用[4]。THUMPD 结构域编码的RNA 结合蛋白成员与许多恶性肿瘤的生物学行为和预后密切相关。为研究THUMPD2 在卵巢癌中表达的差异及临床意义，本研究选择2010 年1 月—2020 年12 月卵巢良、恶性肿瘤手术切除标本为研究对象，检测卵巢癌组织中THUMPD2 表达水平，并探讨THUMPD2 与患者临床病理参数及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集 2010 年1 月—2020 年12 月南通大学附属医院存档的47 例卵巢癌标本，包括浆液性卵巢癌29 例，黏液性囊腺癌10 例，内膜样腺癌8例；国际妇产科联合会(Federation International of Gynecology and Obsterics,FIGO)分期：Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ期25 例，Ⅳ期8 例；分化程度：Ⅰ级10 例，Ⅱ级17 例，Ⅲ级20 例；无腹水13 例，有腹水34 例。全部患者均行卵巢癌肿瘤细胞减灭术，术前未行化疗、生物治疗及免疫治疗，无合并其他恶性肿瘤。随机选取同期因卵巢良性肿瘤行附件切除的卵巢组织标本30 例作为对照。统计47 例卵巢癌标本的临床病理资料，包括患者年龄(＜50 岁和≥50 岁)、组织分化程度、FIGO 分期以及淋巴结转移等。本实验所有标本均与患者签署知情同意书并经南通大学附属医院伦理委员会审核批准(审查编号：2021-L084)。

1.2 主要试剂 THUMPD2 鼠抗人单克隆抗体购自美国圣克鲁斯公司(sc-393018)，免疫组织化学两步法试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.3 免疫组织化学染色及结果评判 对标本库保留的组织石蜡块进行5 μm 连续切片，常规脱蜡，乙醇梯度脱水，抗原修复，4 ℃抗体(1∶100 稀释)孵育过夜；二抗孵育30 min，二氨基联苯胺显色，苏木精对比染色，中性树胶封片。根据Beesley 分级法标准，以细胞核及细胞质中出现棕褐色颗粒的比例作为THUMPD2 蛋白阳性染色的标准。细胞不染色为阴性，记0 分；细胞核及细胞质呈现棕黄色颗粒为阳性，淡黄色记1 分，棕黄色记2 分，棕褐色记3 分。按阳性细胞所占百分比记分，＜5%为0 分，5%～25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%为3 分。将以上两项分数相加即为着色程度的积分：0～2 分为低表达，3分为中表达，≥4 分则为高表达。由两位经验丰富的病理科医师独立评估THUMPD2 的表达情况。

1.4 患者生存期随访 对受检卵巢癌患者进行电话随访，以出现因卵巢癌死亡作为观察终点。随访截止日期为2021 年12 月。

1.5 统计学方法 使用SPSS 20.0 软件进行统计分析，采用χ2检验或Fisher 精确检验法进行病理分析，运用Kaplan-Meier 进行生存分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 THUMPD2 蛋白在卵巢组织中的表达 THUMPD2蛋白在卵巢良性肿瘤及卵巢癌组织细胞质及细胞核中有表达。THUMPD2 在卵巢良性病变组织中呈中表达；在Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌组织中呈低表达，阳性率显著低于卵巢良性病变组织；在Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌组织中呈高表达，阳性率显著高于卵巢良性病变组织(P＜0.01,图1)。

图1 THUMPD2 在卵巢癌及卵巢良性肿瘤组织中的表达(200×)

2.2 THUMPD2 蛋白在卵巢癌中的表达差异与癌临床病理特征的关系 为了解THUMPD2 蛋白在卵巢癌发生、发展中的作用，对其不同表达情况与卵巢癌临床病理特征的关系进行分析发现，THUMPD2 蛋白的表达水平与卵巢癌患者年龄、组织学类型、分化程度及腹水形成无显著相关性，但与FIGO 分期及肿瘤是否发生转移密切相关(P＜0.05)。其中，THUMPD2蛋白在早期(Ⅰ+Ⅱ期)组织中呈低表达(P=0.013)，低表达率78.6%，在晚期(Ⅲ+Ⅳ期)组织中呈高表达(P=0.009)，高表达率为84.8%，见表1。

2.3 THUMPD2 蛋白的表达差异与患者生存期的关系 Kaplan-Meier 生存分析显示，THUMPD2 的表达差异对卵巢癌患者生存期有显著影响。在全部卵巢癌病例中，THUMPD2 蛋白高表达者的总生存期明显低于THUMPD2 蛋白低表达者(Log.rank=4.150,P=0.028,图2A)。在晚期卵巢癌(Ⅲ+Ⅳ期)患者中，THUMPD2 蛋白高表达者总生存期也明显低于THUMPD2 蛋白低表达者(Log.rank=7.124,P=0.006,图2B)。

3 讨 论

目前，卵巢癌的首选治疗方式是肿瘤细胞减灭术联合铂类化疗。即使有极好的手术切除和精心设计的化疗方案，70%的患者在3 年内复发，具有耐药表型和转移扩散，5 年生存率＜50%。卵巢癌发生发展机制还需进一步探索。

THUMPD2 是一种含有THUMP 结构域的编码蛋白，因其存在于硫尿苷合酶RNA 中而得名[5]。THUMP 结构域是一种RNA 结合域并用于招募RNA 分子，并通过同一区域内的催化域进行修饰多肽或伴侣蛋白[6]。这种新的RNA 结合结构域THUMP(硫尿碱合成酶、RNA 甲基转移酶和伪尿素合成酶)是从预测参与RNA 代谢的各种蛋白质的序列比较中推导出来的[5]，位于2 号染色体(2p22)上，是一种蛋白质编码基因，也称为2 号染色体开放阅读框8(C2orf8)，该基因包含503 个氨基酸，分子质量为56.433 Da。在相当长一段时间，THUMPD2 相关功能研究基本未见报道。最近，已有3 种不同的含THUMP 酶的新实验数据分别是：来自大肠埃希菌的ThiI，来自酿酒酵母的Tan1 和来自P.abyssi 的TrMet(m2.2G10)。所有3 种蛋白质都参与tRNA 修饰，并在tRNA 分子的中心3D 核心中靶向核苷。S.SHARMA等[7]证明了THUMP 结构域蛋白1 是一种特异性衔接蛋白，与NAT10 相互作用，调节tRNA 乙酰化。NAT10 是几种类型癌症的生物标志物，研究[8]表明NAT10 通过减少E-钙黏蛋白促进肝细胞癌的侵袭。H.ZHANG 等[9]发现NAT10 增强了卵巢癌的侵袭能力并与预后不良有关。另有研究[10]发现，在伴有胸膜转移的Ⅳ期肺腺癌患者中，G 蛋白信号调节因子18-下游基因间区间变性淋巴瘤激酶-THUMPD2 融合共存。这一发现表明，THUMPD2 与肿瘤转移之间存在潜在的相关性。最新研究[11]报道含有2 种蛋白质的THUMP 结构域可能在体外人食管鳞状细胞癌细胞中诱导顺铂和5-氟尿嘧啶的耐药性，在体外人食管鳞癌细胞株中，THUMPD2 被鉴定为顺铂/5-氟尿嘧啶耐药基因。推测THUMPD2 可能通过影响药物流入或流出来影响下游基因表达。目前，尚未有THUMP 结构域对卵巢癌发生发展或转移影响的相关研究报道。

为进一步证实THUMPD2 在卵巢癌中出现差异表达，并了解其差异表达的意义。本研究对南通大学附属医院保存的卵巢癌组织进行免疫组织化学染色，发现THUMPD2 在卵巢癌不同阶段的表达不同。在早期卵巢癌(Ⅰ+Ⅱ期)中，THUMPD2 表达明显降低，而在晚期卵巢癌(Ⅲ+Ⅳ期)中，THUMPD2 的反而升高。THUMPD2 差异表达发生的可能机制与THUMPD2 在早期卵巢癌和晚期卵巢癌中不同的调控机制有关。由于卵巢癌组织早期表现为细胞增殖，晚期多数转移，故推测THUMPD2 在晚期卵巢癌中高表达提示THUMPD2 与肿瘤转移相关。在全部标本中有1 例Ⅳ期卵巢癌组织切片THUMPD2 未显示高表达，可能原因：(1)免疫染色误差；(2)卵巢癌的转移并非完全受THUMPD2 调控。而对研究对象10 年生存期随访研究发现，所有47 例卵巢癌患者生存曲线提示生存期最长为110 个月，晚期卵巢癌(Ⅲ+Ⅳ期)总生存期分析提示患者最长生存期为68 个月。此结果并非提示卵巢癌的最大生存期为110 个月，出现此种异常曲线的原因是：本研究随访时间为10年，受病例数限制，最早1 例患者发病时间为2010年3 月，于2019 年12 月死亡，生存期为110 个月，故在曲线上表现出的无生存期＞110 个月的现象。晚期卵巢癌患者5 年生存率不满30%，同样受病例数的限制，图2B 显示的最长生存期为68 个月。虽然生存曲线图无法体现卵巢癌患者的最大生存期，但客观记录了这47 例卵巢癌的生存期变化趋势，可以显著反映THUMPD2 低表达和高表达对患者生存期的影响。THUMPD2 高表达组的总生存期显著缩短，同样在晚期卵巢癌患者中，THUMPD2 低表达组生存期显著长于高表达组。THUMPD2 的高表达主要出现在晚期卵巢癌中，且提示卵巢癌患者预后不良，可能是由于肿瘤细胞转移能力增强所致。THUMPD2低表达的晚期卵巢癌患者的生存期延长可能得益于转移的减少。本研究结果表明，THUMPD2 在早期卵巢癌和晚期卵巢癌中出现了两极分化的差异表达，且与卵巢癌患者的生存期有关。THUMPD2 在卵巢癌中的具体作用机制及其上游受何种基因调控乃至下游调控哪些靶基因发挥效应均值得深入研究。在进一步的研究中，将根据RIP-RNA 测序结果，找出与THUMPD2 直接相互作用的靶基因，并研究其如何参与调节卵巢癌的进展和转移。总之，本研究结果为THUMPD2 在卵巢癌发生和进展中的作用提供了新的机制见解。