基于网络药理学探究黄连解毒汤治疗溃疡性结肠炎的作用机制研究

杨振寰，贾子君，索菲娅，朱晓燃，姚树坤

(1. 北京中医药大学，北京 100029；2. 中日友好医院，北京 100029)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)属于炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的范畴，主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便，以发作、缓解及复发交替为疾病特点，好发于直肠和乙状结肠，是消化系统的常见病、多发病、疑难病。目前UC的病因与发病机制尚不明确，普遍认为环境、遗传、免疫和肠道微生物等多种因素在UC的发生发展中起关键作用[1]。现代医学采用的水杨酸制剂、免疫抑制剂、生物制剂等药物可缓解UC症状，但存在复发率高、不良反应多、价格昂贵、患者依从性差等缺点。近年来中医药治疗UC取得了较好的效果，存在不良反应少、复发率低、患者依从性好的优势，可以明显改善UC患者症状，修复肠道黏膜，降低疾病活动度，提高其生活质量。UC 归属于中医“痢疾”“久痢”“肠澼”等范畴，活动期主要病机为湿热蕴结、气血不和，甚则兼挟热毒、痰浊、瘀血[2]。黄连解毒汤出自《肘后备急方》，但有方无名，名见《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏、栀子按3∶2∶2∶3比例组成，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，主治实热火毒、三焦热盛之证，可用于治疗急性肠炎、脓毒症等属热毒患者。基础研究表明，黄连解毒汤可能通过抑制NF-κB信号通路，激活Nrf2信号通路，增强肠屏障功能，降低UC小鼠结肠组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平而发挥抗炎作用[3-4]。临床研究表明黄连解毒汤联合美沙拉嗪治疗后，UC患者变形菌门丰度下降、厚壁菌门丰度升高，还可以显著改善肠道菌群失调症状[5]，但该方治疗 UC 的作用机制尚不清楚。由于中药复方制剂组方复杂，成分众多，常规的药理学研究难以全面揭示其潜在的作用机制，网络药理学符合中医药系统性和整体性的思维模式，可以通过构建“疾病-基因-药物”网络分析药物的潜在作用机制[6]。崔晓娟等[7]基于网络药理学分析发现龙血竭可以缓解UC小鼠结肠黏膜损伤，可能通过黄酮类成分调控ABL1、JAK2、IL-6、PTGS2蛋白表达，进而干预JAK2/STAT3、PI3K-AKT-m TOR通路，调节炎症因子的水平。考虑到中药治疗疾病涉及多成分、多靶点、多通路的特点，本文从网络药理学的角度对黄连解毒汤治疗 UC 的主要有效成分、靶点和通路进行了预测分析，评估药物与相关基因的作用关系，为后期临床研究与基础实验提供新的思路与方向，也为治疗UC新的中药单体的开发提供理论依据。

1 资料与方法

1.1黄连解毒汤的活性成分及靶点 从中药系统药理数据库(TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)获取黄连解毒汤的4味中药“黄连”“黄芩”“黄柏”“栀子”的化学成分，设置化合物的类药性(drug-like，DL)和口服利用度(oral bioavailability，OB)作为筛选参数，选取DL≥0.18且OB≥30%的药效成分库，整理活性成分所涉及的靶点，再通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)进行靶点基因注释。

1.2UC相关基因的选取 通过人类基因组注释数据库(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://www.omim.org/)数据库进行检索，筛选UC相关基因，将获取的UC基因与黄连解毒汤的靶点基因对比，取两者交集，筛选出共同基因，利用R软件制作韦恩图。

1.3有效成分-靶点-疾病网络的构建 将药物活性成分、共同基因的对应关系导入网络可视化软件Cytoscape 3.8.0，绘制“黄连解毒汤活性成分-靶点-溃疡性结肠炎”网络图。

1.4蛋白与蛋白互相作用(protein-protein interaction，PPI)网络的构建与核心靶点的分析 将共同基因导入STRING数据库(https://string-db.org/)，物种选择为“homo sapiens”，绘制黄连解毒汤治疗UC靶点PPI网络互作图，设置high confidence=0.7作为最低互作分数。使用R语言计算各主要蛋白之间的互作次数，找到核心靶点，生成barplot核心靶点图。

1.5GO功能富集与KEGG通路富集分析 使用R软件对黄连解毒汤与UC的共同靶点进行GO功能富集与KEGG通路富集分析，筛选出黄连解毒汤治疗UC的主要分子功能和信号通路。

2 结 果

2.1黄连解毒汤活性成分和潜在靶点 根据DL≥0.18且OB≥30%的条件筛选，获取黄连的有效成分14个，黄芩36个，黄柏37个，栀子15个，去除重复的活性成分如MOL000098 quercetin(槲皮素)、MOL000358 beta-sitosterol(β-谷甾醇)、MOL000449 Stigmasterol(豆甾醇)等共获得86个活性成分。汇集每个活性成分所涉及的潜在靶点后，再通过Uniprot数据库比对校正后去重，共获得244个潜在靶点。

2.2UC相关基因 以“ulcerative colitis”为检索词，在Genecards数据库里共找到4 356个疾病相关基因，在OMIM数据库里找到199个疾病相关基因，与黄连解毒汤活性成分潜在靶点对比，共有152个共同基因，韦恩图见图1。

2.3黄连解毒汤有效成分-靶点-疾病网络 将生成的成分-靶点关系导入Cytoscape 3.8.0软件，绘制黄连解毒汤有效成分-靶点-疾病的网络关系图，图中红的椭圆形为上述152个共同基因，三角形表示黄连解毒汤中能与这些基因反应的有效成分，紫红色代表黄连、蓝色代表黄芩、黄色代表黄柏，橘色代表栀子，共57个有效成分。其中治疗靶点最多的有效成分是来源于黄连、黄柏、栀子的quercetin(槲皮素)，作用靶点为111个；其次为来源于栀子的kaempferol(山柰酚)，作用靶点37个；来源于黄芩的wogonin(汉黄芩素)作用靶点35个、baicalein(黄芩素)作用靶点26个、acacetin(金合欢素)作用靶点17个、Moslosooflavone(苏荠苎黄酮)作用靶点16个；来源于黄芩、黄柏、栀子的beta-sitosterol(β -谷甾醇)作用靶点16个；来源于黄柏的rutaecarpine(吴茱萸次碱)作用靶点14个。具体见图2、表1。

表1 黄连解毒汤治疗溃疡性结肠炎的有效成分

续表

2.4核心靶点互作图 将上述152个共同靶点导入STRING数据库中，选取打分值高于0.7的高置信度蛋白互作关系数据，获得蛋白相互作用图，见图3。图中圆形节点表示每个基因蛋白，节点之间的直线代表该直线连接的2个蛋白有相互作用关系(如共表达、蛋白质同源性、基因邻接、基因融合等)，线越粗代表作用关系越强。应用R语言得到互作关系排名前30的靶点。Barplot图显示AKT1、TP53、MAPK1、JUN、IL6、TNF、MAPK8、VEGFA、MYC、CXCL8、EGFR、IL1B、MMP9、CCND1、EGF、PTGS2、IL10、IL4、MMP2等基因排名靠前，为核心靶点，具体见图4。

2.5GO功能富集分析 使用R软件对黄连解毒汤与UC的共同靶点进行GO功能富集分析，共富集155个GO功能。选取富集数基因靠前的30个GO条目作图,Y轴GO条目代表生物过程,X轴代表目标基因集中属于GO的基因比例，气泡面积大小代表富集的基因数量,气泡颜色代表富集显著性，颜色越深表示P值越小。筛选出30个富集基因数靠前的分子功能，见图5。主要影响DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合、DNA结合转录激活因子活性及RNA聚合酶Ⅱ特异性、受体配体活性、细胞因子活性等。

2.6KEGG通路富集分析 使用R软件对黄连解毒汤与UC的共同靶点进行KEGG通路富集分析，共筛选出156条信号通路，其中富集基因数较多有AGE-RAGE信号通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、Th-17细胞分化、Toll样受体(TLR)信号通路和一些癌症相关的信号通路，在炎症、细胞增殖、分化和凋亡过程中起着重要的调节作用，具体见图6。与UC相关性比较大的有25条信号通路，见表2。采用Cytoscape软件绘制黄连解毒汤主要有效成分-核心靶点-主要信号通路网络图,见图7。其中黄色代表主要有效成分、褐色表示主要信号通路，绿色表示核心靶点。从图中可见, 黄连解毒汤的主要活性成分Quercetin(槲皮素)、Kaempferol(山柰酚)、acacetin(金合欢素)、wogonin(汉黄芩素)、baicalein(黄芩素)、Berberine(小檗碱)等作用于不同靶点和信号通路。

3 讨 论

黄连解毒汤具有良好的抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化作用[8]，动物研究表明黄连解毒汤可减轻UC小鼠肠黏膜损伤，通过JAK2/STAT3途径下调JAK2、STAT3的表达，降低结肠巨噬细胞免疫反应性，减轻炎症反应[9]。本方苦寒，适用于UC活动期热毒炽盛证或大肠湿热证患者，患者不可多服、久服，应根据患者证候变化随证加减。鉴于以往研究多是基于单通路，大数据的网络药理学已广泛应用于分析复杂成分的中药方剂作用机制，故本研究基于多成分、多靶点作用的研究思路，应用网络药理学的方法对黄连解毒汤中的有效成分进行筛选，预测治疗UC的关键靶点和信号通路，阐述其治疗UC潜在作用机制。

表2 黄连解毒汤治疗溃疡性结肠炎的共同靶点主要通路 KEGG 富集分析

既往研究表明黄芩提取物黄芩苷可以减轻氧化应激和炎症反应[10]。黄连中有效成分小檗碱具有抗炎活性，临床可用于治疗慢性肠炎及腹泻患者，调节Th17细胞的反应，改善上皮屏障功能，抑制脂质过氧化来减轻急性或慢性结肠炎[11-12]。本研究中除了黄芩苷、小檗碱，还发现了源于黄连、黄柏、栀子的Quercetin(槲皮素)，来源于栀子的Kaempferol(山柰酚)，来源于黄芩的Wogonin(汉黄芩素)、Baicalein(黄芩素)、Acacetin(金合欢素)、Moslosooflavone(苏荠苎黄酮)，来源于黄芩、黄柏、栀子的beta-sitosterol(β -谷甾醇)，治疗UC的靶点也较多，而目前关于这些中药单体治疗UC的研究仍然较少，值得进一步开发研究。

AKT也被称为蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，在黄连解毒汤治疗UC的关键靶点网络关系中处于核心地位。AKT活性是在受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)下游调节的，如表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。AKT是PI3K-AKT通路的核心靶点，位点被磷酸化后，结合在细胞膜上的AKT即完全激活[13]。MAPK是细胞内信号转导的重要途径，参与调节细胞的分化、增殖、分裂和凋亡。除了细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)，MAPK家族还有另外两个成员，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38激酶(p38 MAPK)[14-15]。IBD的慢性黏膜炎症是由于效应性免疫细胞过度激活，产生高水平的促炎细胞因子，如TNF-α、IL-6和IL-1，导致结肠组织损伤，NF-κB被认为是这一免疫学环境中的关键调节因子之一[16]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一种内肽酶，生理条件下，MMPs在组织重塑和创伤修复中发挥重要作用，然而表达失调会导致过度和持续的炎症反应，进而损伤肠道。MMP-9是一种由结肠上皮和中性粒细胞释放的明胶酶,参与Ⅳ型胶原的降解，UC患者结肠表面上皮细胞MMP-9蛋白表达增强，可能通过提高肠上皮细胞肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)的表达使肠黏膜通透性增高进而参与IBD的发生[17-18]。所以本研究中发现的黄连解毒汤治疗UC的有效成分如槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素、金合欢素、苏荠苎黄酮、β -谷甾醇等调控AKT1、MAPK1、IL6、TNF、VEGFA、CXCL8、IL1B、MMP9、PTGS2、IL10、IL4等关键靶点表达，说明黄连解毒汤的有效成分可以降低肠道炎症、调控细胞凋亡、改善肠屏障功能，从而促进UC肠黏膜修复。

PI3K是细胞内信号的一种脂类第二信使,PI3K/AKT信号传导通路在调控凋亡、调节免疫、肠道炎症反应中发挥重要作用。PI3K/AKT信号通路是NF-κB的上游激活剂，NF-κB 的活化可以诱导促炎因子、趋化因子、黏附分子以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)的表达，进而趋化大量中性粒细胞等炎性细胞浸润。研究表明氧化苦参碱、黄芩苷能通过PI3K/AKT途径抗炎、调控凋亡、下调Th1和Th17细胞分化，从而显著改善UC[19-20]。p38 MAPK信号通路是MAPK信号通路之一，在炎症、细胞凋亡过程中起重要作用[21]。研究表明参苓白术散可通过阻断p38 MAPK信号通路,降低TNF-α并升高IL-4表达水平,改善UC大鼠结肠黏膜炎症修复[22]。

先天性和获得性免疫反应是IBD发生发展的重要因素。Th17参与了IBD的发病过程，成为治疗IBD的重要靶点[23]。Th17能够产生IL-17细胞因子，由于其在黏膜免疫反应中的促炎作用，在IBD中起着关键的致病作用。因此，调节Th17细胞的分化和功能目前被认为是治疗IBD肠炎的一个潜在的可行靶点。研究表明姜黄素治疗组小鼠结肠组织中的IL-6、p-STAT3、RORγt、IL-17明显降低，TGF-β含量明显升高，提示姜黄素可能是通过调节Th17细胞分化，调控Th17/Treg平衡，从而改善结肠炎症[24]。Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是一类在天然免疫系统中发挥重要作用并参与炎症过程的蛋白质，在IBD的发病机制中起着核心作用。TLR信号转导通路的激活诱导了许多发挥宿主防御功能的基因，包括炎性细胞因子、趋化因子和抗原提呈分子[25]。与分泌蛋白MD-2和CD14一起刺激下游信号转导分子，激活NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)，诱导效应细胞的炎症介质的表达[26-27]。

综上所述，黄连解毒汤治疗UC的机制可能为通过槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素、金合欢素、苏荠苎黄酮、β -谷甾醇等成分调控AKT1、MAPK1、IL6、TNF、VEGFA、CXCL8、IL1B、MMP9、PTGS2、IL10、IL4等靶点表达，进而调控PI3K-AKT、MAPK、TNF、IL-17、TLR信号通路，降低炎症因子的水平、调节肠黏膜免疫、调控细胞凋亡、改善肠屏障功能，最终缓解UC结肠黏膜损伤，体现了黄连解毒汤可以多成分、多靶点、多通路治疗UC。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。