枸杞多糖对肝纤维化大鼠血液及肝组织中IGF-2和IGFBP-2表达的影响

高 深，霍丽民，韩艳珍，栗志英，任海霞，单铁英

(1. 邯郸市第一医院， 河北 邯郸 056002；2. 河北工程大学附属医院，河北 邯郸 056002；3. 河北工程大学医学院，河北 邯郸 056002)

肝纤维化是由于一些致病因子长期作用而引起的肝组织结构异常变化，肝组织病理学切片显示肝小叶结构破坏，肝细胞出现坏死，周围的结缔组织增生[1-2]。这种改变造成肝功能降低，此时如若不给予适当的治疗，病变范围会扩大到整个肝组织，更有甚者肝组织会发生癌变。目前有效并及时防治肝纤维化是医学研究的焦点。枸杞多糖是从枸杞子的众多成分中分离出来的一种混合物质，其包含多种对机体有益的成分。体内外的实验研究表明，枸杞多糖有增强机体免疫功能、减轻自由基对组织的损伤、抑制癌变进展等功效[3-6]，但其对肝纤维化的作用以及机制研究尚少。胰岛素样生长因子-2 (IGF-2)和胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)参与多种器官的纤维化过程，本实验通过观察枸杞多糖对肝纤维化大鼠血液和肝组织中IGF-2、IGFBP-2表达的影响，探讨了其抗肝纤维化的可能作用及机制，现将结果报道如下。

1 实验材料和方法

1.1实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠18只，周龄6 ～8周，体重(180±20)g，河北中医学院动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2019-6-012。大鼠均在动物实验室饲养，12 h光照，环境温度为22～24 ℃，湿度为50%～65%，通风良好，分笼饲养，6只为1笼，整个实验过程大鼠给予常规饮食和饮水。

1.2主要试剂 枸杞多糖购自深圳乐芙生物科技有限公司。IGF-2和IGFBP-2蛋白抗体由武汉明德生物科技股份有限公司提供，ELASA试剂盒由福建艾杰尔进出口有限公司提供。

1.3实验方法 大鼠采用3% 戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后，在腹中线的偏右侧切开大鼠腹部，探索到胆总管并将其结扎，缝合腹腔，常规饲养。3周后选取模型制备成功的12只大鼠，随机分为模型组和枸杞多糖各6只，分2笼单独饲养；另选取同品种的正常SD大鼠6只作为对照组。枸杞多糖组每日给予枸杞多糖30 μg/g灌胃，模型组和对照组给予等量的生理盐水灌胃，均1次/d，连续灌胃30 d。

1.4检测指标及方法

1.4.1肝脏组织HE染色病理观察 灌胃30 d后，分别切取每组大鼠的肝组织，洗净晾干后浸入固定液中，投入浓度渐渐升高的酒精中脱掉组织中的水分，浸入二甲苯里增加组织透明度，埋入溶解好的石蜡液里并冷却，将变硬的组织块切为4.5 μm的薄片，放在载玻片的表面，充分烤干。将充分烤干的组织切片浸入二甲苯溶液去掉石蜡，依次投入浓度渐渐降低的酒精中，经碱性苏木素、酸性伊红染色，晾干后在其表面封上盖玻片，在200倍镜下，每张标本选取5个视野进行观察。

1.4.2血清IGF-2和IGFBP-2水平 灌胃30 d后，收集每组大鼠腹主动脉血液，将其离心后留取血清备用。按照酶联免疫吸附试剂盒中的方法和步骤，检测各组大鼠血清IGF-2和IGFBP-2水平。

1.4.3肝组织中IGF-2和IGFBP-2蛋白表达量采用蛋白印迹技术检测。取每组大鼠等量的肝组织研磨为匀浆，分离出组织浆液中的蛋白质，移液器吸取适量蛋白滴入盛有十二烷基磺酸钠的EP管中混匀并至沸水中，取出冷却，滴入电泳胶块上端的孔中，将胶块放入电泳槽中，在适度的恒定电压和电流条件下电泳2.5 h。截取含有蛋白条带的凝胶，与薄膜紧贴并一起放入转移液中，将凝胶中的蛋白转入紧贴的膜中，再将膜依次浸入不含脂的奶粉溶液、抗体(IGF-2和IGFBP-2)、洗液、二抗液中。在没有光线的地方显色、显影并定影于X射线片上，扫描其上的蛋白灰度，用ImageJ2X软件对每个条带进行定量分析。GAPDH作为内参，目的蛋白相对表达量=目的蛋白吸光度值/内参吸光度值。

2 结 果

2.13组大鼠肝组织病理形态比较 对照组肝脏切面显示每个小叶和其周围的汇管区结构正常；模型组肝组织中显示大小不一的坏死区，汇管区的结缔组织增生，小叶间胆管的管腔扩大且数量增多；枸杞多糖组肝组织坏死区范围减小，汇管区的结缔组织成分减少，小叶间胆管的管腔减小且数量减少。见图1。

2.23组大鼠血清IGF-2和IGFBP-2水平比较模型组大鼠血清IGF-2和IGFBP-2水平均明显高于对照组(P均<0.05)；枸杞多糖组大鼠血清IGF-2和IGFBP-2水平均明显低于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 对照组和肝纤维化各组大鼠血清IGF-2和IGFBP-2水平比较

2.33组大鼠肝组织中IGF-2和IGFBP-2蛋白表达量比较 模型组大鼠肝组织中IGF-2和IGFBP-2蛋白相对表达量均明显高于对照组(P均<0.05)；枸杞多糖组大鼠肝组织中IGF-2和IGFBP-2蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)。见图2及表2。

表2 对照组和肝纤维化各组大鼠肝组织中IGF-2和IGFBP-2蛋白相对表达量比较

3 讨 论

枸杞多糖是从枸杞子成分中分离出来的一种混合物，它由糖类、微量元素、矿物质、维生素等许多成分构成。相关研究证实，枸杞多糖能通过减轻机体炎症反应来阻止疾病的进展[5-6]，而肝脏纤维化病变的发生与慢性炎症反应密切相关，因此本研究探讨了枸杞多糖对肝脏组织纤维化损伤是否有修复功能。

本实验通过阻塞胆总管的方法建立肝纤维化模型，此种方法造模成功率高。其机制为阻止肝脏中的胆汁不能以正常的途径流出，从而淤积在肝内的小胆管中，初期肝内的小胆管先后出现代偿性的表现(管腔扩大、数量增多)，后期胆管中的胆汁流到肝组织中，压迫血管使肝组织得不到营养而坏死，炎性细胞游走到坏死组织的附近，肝组织修复损伤时出现结构紊乱的假小叶。

肝纤维化是多种原因引起的慢性肝病进展所致的组织病变。生理条件下，肝组织中的结缔组织成分的合成与分解处于动态平衡状态，倘若由于某些病理因素造成合成量超过分解量，即可导致肝组织出现纤维化改变[7-9]。在肝脏组织纤维化进程中，肝星状细胞的功能异常活跃，可合成和分泌多种生物学因子如IGF-2，这些生物学因子在组织纤维化的进展中扮演着重要的角色[10-11]。其中IGF-2与其受体结合后参与并促进心脏、肺脏、肝脏等多种器官、组织纤维化进程[12-14]。

IGFBP-2主要由肝脏合成后释放到组织液或血液循环中，其往往不单独存在，常与IGF分子的特定区域结合为复合物，从而对IGF分子的活性起到调节作用，其参与肝纤维化的发生和发展[15-17]。刘立新等[18]体外培养经TGF-β1诱导并活化的肝星状细胞发现，在被激活的肝星状细胞的胞质中IGFBP-2表达增加；申凤俊等[19]发现在大鼠肝纤维化形成过程中，随着时间的延长，大鼠血液中IGFBP-2含量逐渐增加；周凯华等[20]发现随着患者肝组织纤维化程度的加重，IGFBP-2在血液中的含量也逐渐增加。这些实验研究均表明IGFBP-2在肝组织纤维化的进程中发挥着重要作用。

本实验结果显示，肝组织纤维化大鼠血清IGF-2、IGFBP-2水平及肝组织中IGF-2、IGFBP-2蛋白表达量均明显升高，这与既往文献研究结果相一致；枸杞多糖组大鼠血清IGF-2、IGFBP-2水平及肝组织中IGF-2、IGFBP-2蛋白表达量均明显降低。提示枸杞多糖可以通过调节血液和肝组织中IGF-2和IGFBP-2的表达来减轻肝纤维化损伤，但是尚不清楚枸杞多糖在体内是通过何种信号传导途径发挥此种效应的，还需后续实验进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。