药品水分测定方法的选择及策略

周 浩，王慧洁，赵媛媛，王 欢，张士博

（正大天晴药业集团股份有限公司，南京 211100）

药品中的水分包括结晶水和吸附水，水分含量对药品的合成、理化性质、制剂工艺、储藏条件和疗效均有影响，控制药品的水分可预防药品吸潮、霉变、水解、氧化等［1］334。在化学药的合成过程中，反应体系的水分控制对反应结果和产品质量的影响至关重要［2］。由于化学结构和晶型的特殊性，一些原料药的稳定性受水分影响较大，在生产和制备过程中需控制环境湿度并尽量避免水分的影响。鲍兴嘉等［3］通过引湿性试验、影响因素试验和长期/加速稳定性试验研究了湿度对达比加群酯甲磺酸盐无定形转晶的影响。很多药用辅料及原料药均含有结晶水，结晶水的比例直接影响药品的理化性质、溶出和药效等，测定结晶水的含量对化学药的结构确证和晶型表征有重要作用。水分对青霉素类抗生素的稳定性影响也很大，含水量越高，青霉素越易降解，越易失效。国内外药典对几种常用青霉素类抗生素含水量均作出规定：《欧洲药典》青霉素钠干燥失重限度为1. 0%、青霉素V钾及苯氧甲基青霉素水分限度分别为1. 0%、0. 5%［4］1958-3534；《中华人民共和国药典》青霉素V 钾水分限度为1. 5%、青霉素钠及其注射剂干燥失重限度分别为0. 5%、1. 0%［5］730-737。因此，在药物研发阶段，需开发可靠的水分测试方法对起始物料、中间体、原料药和制剂产品进行水分检查并结合药品自身特点、生产工艺、包装形式、储存和使用方式制订合理的限度，以保证药品质量。

由表1 和表2 可知，药典收载的水分测试方法可以归纳为4类，即费休氏法、重量分析法（包括常压干燥法、减压干燥法和热重分析法）、甲苯法和气相色谱法，各通则均对方法测试原理、试液、溶剂、方法适用性、供试品含水量和取样量等进行了详细阐述。与其他方法相比，费休氏法是唯一基于化学定量反应的水分测试方法，具有专属性强、重复性好、准确度高和适用范围广等优点，是国际上通用的水分测试方法。虽然费休氏法水分测试方法有诸多优点，但应用此法进行药品水分测试依旧存在很多问题。这些问题主要包括：（1）反应性问题；（2）溶解度问题；（3）供试品处理问题。针对以上问题，本文重点介绍费休氏法，并结合供试品的理化性质和药典实例总结药品水分测试方法的选择与研究思路。

表1 各国药典收载的水分测试方法

表2 各种水分测试方法对比[1]334-343

1 费休氏法水分测试方法

费休氏法是Karl Fischer 在1935 年提出的水分测试方法，根据碘的来源，分为容量滴定法和库仑滴定法，二者均以卡尔费休氏反应为基础。本法是根据碘和二氧化硫在合适的醇和碱的存在下与水定量反应来测定水分，碘和水的化学计量比为1∶1，反应通式如下［1］334-335：

容量滴定法中，碘是作为滴定剂通过滴定管加入，从消耗碘的量可测定水分含量，计量原理为体积计量。库仑滴定法中，碘是由含有碘离子的阳极电解液电解产生，根据法拉第定律，产生碘的量与通过的电量成正比，从消耗的总电量可测定水分含量，计量原理为电量计量。

容量滴定法根据滴定方式分为直接滴定法和剩余滴定法（返滴定法）。根据供试品处理方法分为直接投样法、外部溶解法、外部萃取法和卡式炉水分测定法。有大量文献报道使用费休氏法进行药品水分测试并对测试方法进行了优化和改进［9-14］。因此，采用费休氏法进行水分测试时，需结合供试品特性、测试环境及水分含量选择合理的供试品处理方法，以获得准确的测试结果。

1. 1 费休氏法-直接投样法

直接投样法是最常用的测试方法，常用溶剂为无水甲醇，可添加合适的助溶剂进行增溶，此法适用于溶解性好、无副反应或采取合适的措施可抑制相关副反应发生的供试品水分测试，各国药典收录的大部分品种均采用此法进行水分检查。

1. 2 费休氏法-外部溶解法

外部溶解法采用无水甲醇或混合溶剂将供试品溶解后进行水分测试，适用于水分含量不均匀、黏度大、称量困难、水分释放缓慢和吸水性极强的供试品水分测试。使用本法进行水分测试时，空白溶剂的选择至关重要，首先空白溶剂不与供试品和费休氏试剂发生反应，其次空白溶剂的含水量必须远小于供试品。应用此法需关注环境温湿度对测试结果的影响并做空白校正，各国药典收录的外部溶解法水分测试大部分采用库仑滴定法。张才煜等［15］报道叶酸在甲醇中不溶，测定时水分释放缓慢，测定时间较长，《中华人民共和国药典》收录的叶酸水分测试方法为容量法外部溶解法，溶剂为三氯甲烷-无水甲醇（4∶1）的混合溶液［5］232。格列美脲在甲醇中极微溶解，《美国药典》收录的格列美脲用二甲基甲酰胺为溶剂，采用库仑法外部溶解法进行水分测试［16］。

1. 3 费休氏法-外部萃取法

外部萃取法是通过无水甲醇或混合溶剂将供试品中的水分萃取出来，适用于溶解性较差、水分分布不均匀和辅料有干扰的供试品水分测试。本法对空白溶剂及温湿度的要求同外部溶解法，推荐使用库仑滴定法测试。富马酸喹硫平在甲醇中微溶，《日本药典》收录其水分测试用甲醇4 mL 溶解供试品约0. 1 g，剧烈振摇1 min，2 000 r/min 离心5 min，精密量取上清液1 mL 用库仑滴定法测试，同法制备空白溶液并校正［8］1493。固体制剂由于辅料众多，直接投样很难保证完全溶解且不发生副反应，外部萃取法是其最合适的水分测试方法。例如《美国药典》收录的奥比沙星片水分测试：取供试品5 片，置50 mL 离心管中，精密加入无水甲醇25 mL 并密封，振摇16 h，离心，取一定体积的上清液（含水量约为1 000 ~ 1 500 μg）用库仑滴定法测试，并做空白校正［17］。

1. 4 费休氏法-剩余滴定法（返滴定法）

剩余滴定法通过向供试品中加入过量已标定的费休氏滴定液，利用已标定的水-甲醇标准溶液中微量水分对过量部分的费休氏滴定液进行返滴定。剩余滴定法适用于仪器响应精度不佳的情况下测定结晶水释放缓慢和含水量较低的供试品。《美国药典》收录的葡萄糖酸镁［18］和《日本药典》收录的硫酸小诺霉素［8］1251都因结晶水释放缓慢，采用剩余滴定法进行水分测试。

1. 5 费休氏法-卡式炉法

卡式炉法是在适宜的温度下加热供试品，通过一定流速的氮气，将蒸发出来的水分导入滴定杯中进行测试。本法适用于溶解性较差、成分复杂、存在副反应、水分释放缓慢和吸湿性较强的供试品水分测试。该方法的准确度主要取决于系统排除大气水分的程度，必须监控基线漂移值，并对气体转移造成的误差进行校正。测试参数应慎重选择，需考察气体流速、称样量、加热温度及加热时间对测试结果的影响，防止供试品水分蒸发不完全或分解产生水。《欧洲药典》收录的阿托伐醌采用卡式炉法进行水分测试，加热温度为160 ℃、加热时间为3 min、气体流量为50 mL/min［4］1601。

2 供试品理化性质分析

2. 1 供试品反应性分析

供试品可能会与费休氏试剂及测试过程生成的氢碘酸发生各种反应，为了获得准确的测试结果，应避免或尽量减少这些副反应。常见副反应有羟醛缩合反应、酯化反应、氧化还原反应、中和反应和复分解反应等，反应类型、反应方程式及反应方式详见表3。

表3 费休氏法水分测试过程常见副反应

与甲醇反应：部分醛、酮、强酸、硅醇基团和硼化合物可以与甲醇发生反应并生成水，生成水的速率取决于所使用的试剂和供试品。此类供试品水分测试可以使用醛酮专用试剂或卤化醇作为溶剂。《美国药典》收录的马来酸吡格列酮的水分测试中注明马来酸与甲醇反应产生水，滴定剂和溶剂都必须不含甲醇［19］。

与碘反应：还原剂和氧化剂会直接或间接与费休氏试剂中的碘发生反应，影响供试品的原始含水量，例如硫醇、苯酚、抗坏血酸、青霉素副产物等。此类供试品水分测试可在测试体系中加入水杨酸抑制碘的氧化或采用快速费休氏试剂减少副反应的发生［20］。Sherman 等［21］提出在非水介质中使用一种由碘、碘化钾和醋酸钠组成的新试剂，可准确测试维生素C片剂的水分。

与滴定反应生成的弱酸反应：含有碳酸盐、氢氧化物、氧化物、羰基和过氧化物的供试品易与反应生成的氢碘酸和亚硫酸氢盐反应。此类供试品可通过卡式炉进行水分测试或在溶剂中加入适量的碱（咪唑、吡啶）消除副反应。Cachet等［22］报道采用10% 咪唑无水甲醇溶液可有效抑制红霉素酸降解生成红霉素烯醇醚和水的副反应。《中华人民共和国药典》收录的红霉素，采用10% 咪唑无水甲醇溶液溶解供试品后进行水分测试［5］521。

药品研发过程中涉及水分测试的样品众多，由于结构和成分的复杂性，部分副反应的机制暂未明确。根据理论知识和药品水分测试经验，总结出以下副反应判断依据：（1）测试体系溶液的颜色（供试品溶解后呈无色），正常测试结束时溶液呈淡黄色，若呈深红棕色或其他颜色，则可能存在副反应；（2）测试体系是否有气泡、烟雾或沉淀产生；（3）测试过程滴定曲线的变化，正常滴定曲线呈S型；（4）正常滴定时间内是否出现滴定终点（与预期含水量对比），部分副反应消耗碘或产生水使滴定时间延长。

2. 2 供试品的酸碱性

卡尔费休氏反应是pH 依赖的可逆反应，最佳pH 范围为5. 5 ~ 8. 0。pH 过低，会使反应常数降低，反应速度减缓；pH过高，会加速反应，影响反应的化学计量值。此类供试品水分测试可添加弱碱（咪唑）或弱酸（水杨酸）缓冲系统pH。《中华人民共和国药典》收录的紫杉醇注射液水分测试，规定供试品的pH为5. 4 ~ 7. 4［5］1627。

2. 3 供试品的引湿性

部分供试品含有吸湿官能团，吸湿官能团可能包括氨基、羟基、羧基、钠盐、钾盐、铵盐、硅酸铝、寡糖等20种，药物吸湿后在低相对湿度环境中会发生不放湿、部分放湿、完全放湿等现象［23］。此类供试品测试，需严格控制环境的相对湿度与温度，避免供试品引湿或放湿。必要时可在手套箱中操作，或采用外部溶解法、外部萃取法、剩余滴定法和卡式炉法。

2. 4 供试品溶解性分析

部分供试品在甲醇中溶解度有限，需要添加合适的助溶剂进行增溶，保证测试结果的准确性。助溶剂的选择应遵循以下原则：（1）助溶剂不参与卡尔费休氏反应且不影响反应活性；（2）最大程度地增加样品的溶解性；（3）助溶剂的添加量不能超过仪器公司推荐的限值。应避免使用以下会产生副反应或减缓卡尔费休氏反应的助溶剂，例如DMSO、二元醇和三元醇等。目前存在多种市售的含有助溶剂及缓冲介质的费休氏试剂，常用助溶剂及其比例推荐见表4。

表4 常用助溶剂比例

2. 5 供试品含水量分析

水分测试需要结合供试品的含水量选择合适的测试方法和取样量。容量法适用于常量和半微量水分测试（含水量约为0. 1% ~ 100%），对于水分含量低于1% 的供试品，优选滴定度小于2. 0 的费休氏试剂。库仑法（直接投样法）适用于微量水分测试（含水量约为0. 000 1% ~ 0. 1%），尤其是液体和气体的水分测定。如表5所示，各国药典均规定了最佳供试品称样量，《美国药典》详细介绍了供试品最少取样量计算公式。此外，《美国药典》还对胶囊和片剂的取样做了如下规定：（1）如果供试品是胶囊，取至少4 颗内容物的混合物进行检测；（2）如果供试品为片剂，则在已知不会影响结果的温度和相对湿度的条件下，取不少于4 片研磨后测试［7］。

表5 各国药典水分测试供试品称样量要求

3 水分测试方法的选择

每种水分测试方法均有优缺点和适用性，充分了解供试品的理化性质是合理选择水分测试方法及获得准确测试结果的必要前提。基于对方法特异性、水结合类型、样品性质和测试效率的综合考虑，直接加样法和卡式炉水分测定法的对比分析是测定化学性质和热稳定性不明供试品水分含量的最佳方法，外部溶解法和外部萃取法是测定难溶性、吸湿性较强、称量困难、水分分布不均及释放缓慢等供试品水分的首选方法。基于实际研发经验，本文将药品研发过程中的水分测试总结为4类，即黏性固体、多组分固体、粉末状固体和液体水分测试，根据供试品的性状可参考图1 ~ 图4流程进行水分测试方法的选择。方法开发过程可参考《欧洲药典》通则“2. 5. 12 半微量水分测试”适用性验证和“2. 5. 32 微量水分测试”准确度验证进行方法确认。

图1 黏性固体水分测试方法选择流程图

图2 多组分固体水分测试方法选择流程图

图3 粉末状固体水分测试方法选择流程图

图4 液体水分测试方法选择流程图

4 结 论

水分含量不仅是药物研发阶段的重要研究内容，也是与仿制药一致性评价紧密相关的关键质量属性，必须建立合理准确的水分测定标准保证药品的稳定性。水分质量标准的制订需以各国药典为基础，并结合供试品特性合理评估方法的适用性，选择专属性强、重现性佳、准确度高的水分测试方法。本文重点介绍了费休氏法水分测试方法和供试品的理化性质分析，并在此基础上提供了水分测试方法选择的新思路。建议研究人员根据供试品特性和水分含量控制要求，逐步完善水分测试方法和限度标准，合理细化水分测试标准操作规程，更好地保证测试结果的准确性。