血清外泌体中miR-155与儿童癫痫相关性分析

林银花 冯冉冉 冯琳琳 孙勇 王蕾

262100 山东省安丘市人民医院儿科1，山东潍坊

272000 济宁市第一人民院新生儿科2，山东济宁

271000 泰安市中心医院儿科3，山东泰安

266000 青岛西海岸新区人民医院4，山东青岛

癫痫是一种神经系统类疾病，极其具有破坏性，婴幼儿、儿童是高发人群。相关医学统计数据显示[1]，癫痫的终身患病率为1%，儿童、中老年人是高发人群，现阶段，在全球范围内，诊断有癫痫存在的病例数达到了240万人左右。1 d以上发生至少3次无端发作病史、10年内有60%以上并发可能性存在是临床诊断癫痫过程中采用的传统依据[2]。本研究分析了儿童癫痫患儿血清外泌体中miR-155 的表达及临床意义，现报告如下。

资料与方法

选取2020年2月-2021年2月癫痫患儿50例，作为癫痫组，另选取同期健康体检儿童50 例，作为健康组。癫痫组女23例(46.00%)，男27例(54.00%)；年龄2～14 岁，平均(8.32±1.42)岁。健康组女22 例(44.00%)，男28 例(56.00%)；年龄3～15 岁，平均(8.62±1.62)岁。两组患儿一般资料比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究经过伦理委员会批准，且患儿家属均签署知情同意书。

纳入标准：①均经核磁共振成像(MRI)、头部电子计算机断层扫描(CT)等影像学检查确诊为原发性癫痫[3]；②距离最近一次发作时间均在1 周以内。

排除标准：①有脑梗死、脑发育畸形等器质性病变；②有癫痫家族史；③近期有脑外伤。

方法：①血清标本收集：清晨将两组儿童的5 mL静脉血采集下来，放置在室温下，3 h内离心10 min，速率3 000 r/min，将上清液吸取出来，在EP 管中放置，并保存在-80℃的冰箱中。②血清外泌体提取：从-80℃冰箱中拿出血清，在冰上放置溶解，充分溶解血清后用无RAN酶枪头将800 μL从每份血清中吸取出来，向1.5 mL EP管(无RNA 酶)中转移。在4℃的温度下以300 r/min的速率离心10 min，将分离的细胞除去。将上清液收集起来，用0.22 μ m Merck Millipore滤膜过滤，将污染的细胞碎片、微囊小泡、凋亡体除去。用Optima TM L-80XP Ultracentrifuge，Beckman Coulter 离心机分离澄清的上清液，在4℃的温度下以100 000 g/min 的速率离心1.5 h。制作外泌体为小球。小心除去上清液，合并包含外泌体的小球并在1 mL的冰PBS中重悬，然后进行第二次超速离心，在4℃的温度下以100 000 g/min的速率离心1.5 min，旋转体类型同上，在500 μL PBS中重悬产生的外泌体小球。③外泌体miR-155表达测定：运用qRT-PCR法，首先提取外泌体miRNA，依据血清miRNA 提取试剂盒说明书将血清外泌体miRNA 提取出来，用Nanodrop 对miRNA 浓度进行测定。然后进行逆转录反应，应用逆转录试剂盒逆转录miRNA为cDNA，程序为在37℃、85℃的温度下分别逆转录1 h、5 min，在42℃温度下5 min结束逆转录反应后第一时间取出cDNA 产物，以较快的速度在冰上放置冷却，在冰上进行所有后续步骤，不能随便从冰上移走cDNA。最后运用探针法制备定量PCR 反应mix。10倍稀释上述步骤产生的cDNA，在专用PCR 管中放置，将10μL 2×real-time PCR Master Mix+0.4μL Gene specific Primer set+0.2μL Gene specific Probe+0.2 μL Taq DNA polymerase(5 U/μL)+2.0μL RT product+7.2 μL ddH2o (RNase-free)组成的反应体系配制出来。qRT-PCR反应程度为在95℃、95℃、62℃的温度下分别预变性、变性、退火延伸3 min、12 s、12 s，退火延伸过程中将荧光信号采集下来。将内参设定为U6，将三个复孔在每个样品中设立出来，目标基因的相对表达量用2-△△Ct表示。

观察指标：①两组儿童血清外泌体miR-155表达水平；②儿童癫痫早期诊断中miR-155的价值。采用SPSS 软件绘制ROC 曲线，敏感度、1-特异度分别为纵坐标、横坐标。

统计学方法：数据使用SPSS 20.0 统计学软件分析；计量资料用(±s)表示，比较采用t检验，重复测量的计量资料进行方差分析；计数资料以(%)表示，比较采用χ2检验；儿童癫痫早期诊断中miR-155 的价值评定用受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积(AUC)。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

两组儿童血清外泌体miR-155表达水平比较：癫痫组血清外泌体miR-155表达水平为(2.25±0.32)nm，高于健康组的(1.14±0.30)nm，差异有统计学意义(P＜0.05)。

儿童癫痫早期诊断中miR-155 的价值分析：AUC=0.811，诊断临界值为1.490 时，敏感度、特异度分别为83.30%、7.00%。见图1。

图1 miR的ROC曲线

讨 论

癫痫属于一种神经系统性疾病，儿童是高发人群。世界卫生组织资料显示，国际上240 万/年确诊癫痫病例中，小儿癫痫占约70%[4]。在儿童癫痫的诊断中，虽然基因检测、脑电图、脑成像等技术具有辅助诊断价值，但是仍然具有偏高的误诊率[5]。在脑部疾病的诊断中，miRNA 是一种新型潜在生物标志物，内源性核糖核酸酶不会对其造成不良影响。相关医学研究表明，血清miRNA 在癫痫患者中变化明显[6]。外泌体是纳米级囊泡，主要由脂类双分子膜包裹形成，能够将30～100 nm 直径的各类细胞分泌出来，携带脂质、蛋白质、miRNA 等物质，将对废物进行管理、细胞内通讯、将各方面凝聚起来等作用发挥出来。

相关医学学者以上述理论为指导，对小儿癫痫诊断中血清外泌体miR-155 的应用价值进行了探讨，发现血清外泌体miR-155 微囊泡直径在30～100 nm，能够将小儿癫痫患儿血清中成功将外泌体分离出来。同时，小儿癫痫组患儿的血清外泌体miR-155 水平显著高于健康儿童。此外，去除外泌体后血清悬浮液中miR-155 含量也在极大程度上上调。实时定量PCR 方法证实，小儿癫痫患儿具有较高的血清外泌体miR-155 表达，能够将有力依据提供给临床诊断工作[7-8]。本研究结果表明，癫痫组患儿的血清外泌体miR-155 表达水平高于健康组，差异有统计学意义(P＜0.05)。采用SPSS软件将ROC 曲线绘制出来，敏感度、1-特异度分别为纵坐标、横坐标。AUC=0.811，诊断临界值为1.490 时，敏感度、特异度分别为83.30% 、7.00%，和上述研究结果一致，说明在小儿癫痫诊断中，血清外泌体miR-155 分离鉴定与表达能够将有效依据提供给临床。

综上所述，儿童癫痫患儿血清外泌体中miR-155表达升高，能够为临床早期诊断儿童癫痫提供有效依据，其可能在癫痫的发病中参与，在表达超过1.490时，提示可能发生癫痫。