结核病分子生物学检测技术研究进展

樊茹 李晓非

结核病的细菌学和免疫学检测技术的检测时间长、敏感度或特异度欠佳、无法区分活性结核病和结核分枝杆菌潜伏感染等，在一定程度上制约了结核病的早期诊断和治疗。特别是涂片阴性肺结核、肺外结核和结核分枝杆菌潜伏感染缺乏典型的临床表现或影像学特征，且鉴别诊断技术较少，导致结核病的防控形势更加复杂[1]。随着医学科学技术的不断发展，特别是精准诊疗时代的来临，分子生物学检测技术在结核病早期诊断辅助方面受到广泛重视和应用。分子生物学检测技术具有准确、高效、高通量等优点，为结核病的诊疗及疫情的防控带来了新曙光[2]。本文中，笔者综合国内外学者研究成果，对结核病分子生物学检测技术的优缺点及应用现况进行综述。

一、基于核酸扩增技术的结核病检测及药物敏感性分析技术

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)核酸扩增技术通常以IS6110、rpoB、gyrB、IS1081、培养滤液蛋白10(CFP-10)等为靶标，通过PCR进行扩增和检测。2017年，国家卫生和计划生育委员会重新修订发布的《WS 288—2017 肺结核诊断》标准中，已将MTB核酸检测阳性作为结核病的诊断依据之一，可见其对结核病的辅助诊断具有重要的应用价值[3]。

1.利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(GeneXpert MTB/RIF，简称“GeneXpert”)：以GeneXpert检测技术为代表的盒式检测技术的出现标志着结核病分子生物学检测技术出现了新突破。GeneXpert检测试剂盒由美国Cepheid公司开发，适用于GeneXpert仪器。该技术以多重半巢式实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)为实验基础，检测MTB利福平耐药决定区rpoB基因，可在2 h内直接从患者新鲜痰液或冻存痰液中检测是否含有MTB及其对利福平的耐药性[4]。研究显示，对于肺结核患者检测呼吸道标本，GeneXpert检测的敏感度为61.8%～85.0%，特异度为98%～99%[5-8]；对MTB/HIV双重感染者的痰标本，其检测的敏感度为85%[6]；对痰涂片阳性肺结核患者的痰标本，其检测的敏感度达98%[6]；对痰涂片阴性肺结核患者的痰标本，其检测的敏感度为67%[6]；检测结核性脑膜炎患者脑脊液标本的敏感度为23%～52%[9]。基于上述研究，GeneXpert在检测涂片阳性肺结核方面的应用已得到广泛认可；并且对于疑似MTB/HIV双重感染时，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)建议首选GeneXpert进行检测[10]。然而，也有研究表明，GeneXpert检测含菌量低的标本的敏感度下降，限制了其在涂片阴性肺结核和肺外结核患者检测中的使用[6,11]。

2．GeneXpert MTB/RIF Ultra(简称“Xpert Ultra”)：为进一步提高GeneXpert检测的敏感度，美国Cepheid公司推出了第二代GeneXpert检测系统——Xpert Ultra。该检测系统有2个不同的多拷贝扩增靶标(IS6110和IS1081)，并拥有了更大的DNA反应室(由GeneXpert的25 μl体系增加至Xpert Ultra的50 μl体系)[7]。Xpert Ultra还集成了全套核酸扩增和更快速的热循环，这促使其检测下限可达到16 CFU/ml，而GeneXpert为114 CFU/ml[12]。最近进行的一项前瞻性研究结果显示，Xpert Ultra和GeneXpert对137份涂片阴性但培养阳性肺结核患者的痰标本进行检测，敏感度分别为63%和46%；对115份MTB/HIV双重感染患者培养阳性痰标本检测，敏感度分别为90%和77%；Xpert Ultra 和GeneXpert检测的总体特异度分别为96%和98%；相比于初治肺结核患者，Xpert Ultra对复治患者检测的特异度略低，为93%；但Xpert Ultra在检测利福平耐药方面的敏感度与GeneXpert一致[13]。由此可见，在检测含MTB菌量低的标本和MTB/HIV双重感染患者的标本方面，Xpert Ultra的敏感度较GeneXpert有所提高；然而与其他检测技术类似，提高检测敏感度的同时特异度会略微降低[14]。目前，GeneXpert和Xpert Ultra已经在数十个国家获得较为广泛的应用。但是，它们具有同样的缺点，即仅能检测MTB单一利福平耐药rpoB基因的一段热点突变区域，因此，有必要在现有基础上纳入对其他一线、二线抗结核药物的耐药性检测；同时，其检测成本较高，不适合在低收入国家和地区进行推广。

3.Truenat MTB、Truenat MTB Plus和Truenat MTB-Rif Dx：近几年，印度推出了更适合在低收入国家使用的可以同时检测多个靶标、检测效率高且检测成本较低的Truenat系统，包括Truenat MTB、Truenat MTB Plus和Truenat MTB-Rif Dx。该系统被认为是GeneXpert的替代品，已经通过了WHO专家组技术性能的验证并获得了WHO的推荐[15]。Truenat MTB是基于微量逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)和核酸杂交芯片的结核病检测技术。其利用TruePrep仪器(一种可用电池驱动的纳米技术设备)提取痰标本中的DNA(25 min)，在Truelab-UNOTM(电池驱动的手持式热循环仪)上进行PCR扩增并分析报告结果(35 min)[12]。Truenat MTB Plus的原理与Truenat MTB相同，Truenat MTB-Rif Dx作为可选的附加芯片，用于MTB对利福平的耐药性检测[16]。与GeneXpert相比，Truenat MTB的样本使用量更少(由GeneXpert的l ml减少至Truenat MTB的0.5 ml)；其更大的优势在于只有MTB阳性的标本才会进行利福平耐药性检测，大大节省了试剂和检测成本。多项研究显示，Truenat MTB、Truenat MTB Plus和Truenat MTB-Rif Dx对结核病和利福平耐药的检测效能与GeneXpert和Xpert Ultra一致[17-19]。除此之外，区别于其他检测技术只能在受控环境中的特殊实验室内操作，Truenat系统的整套装置由电池提供电源，便于携带，在基础设施不完善的国家和偏远地区的医疗机构也可以使用。

4.基于等温扩增技术的结核病检测技术：环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术在2016年被WHO推荐作为痰涂片镜检的替代技术，用于疑似结核病患者的检测[20]。其扩增原理是在链置换DNA聚合酶参与下，为MTB靶基因的6个不同的特异性区域设计4种特异性引物，使其在恒温条件下短时间(15～60 min)循环，高速有效扩增。这种核酸扩增技术不需要复杂设备或特殊试剂，直接通过肉眼观察是否有绿色荧光或白色沉淀即可判读结果，适合在基层实验室或偏远山区推广[21]。一些研究显示，应用IS6110、gyrB作为LAMP的靶标检测肺结核患者的痰标本，其检测敏感度为82%～99%，特异度为94.0%～96.8%[22-24]。Bojang等[24]研究显示，LAMP和GeneXpert检测肺结核具有相似的高敏感度及特异度。当然，LAMP也存在不足。Joon等[25]为解决该技术可能会因非特异性扩增而导致假阳性结果这一问题，使用尿嘧啶-N-糖基化酶+脱氧尿苷三磷酸法对LAMP技术进行了改良，经临床标本验证显示，改良后的LAMP技术可以消除污染DNA的扩增，同时对疑似肺结核患者的痰标本也表现出较高的检测敏感度(94.4%)和特异度(97.2%)。

二、基于核酸分子杂交技术的结核病检测及药物敏感性分析技术

线性探针技术(line probe assay，LPA)的主要原理是利用生物素化的引物进行PCR扩增，扩增产物与固定于膜上的特异性寡核苷酸探针杂交，根据酶联免疫比色进行结果解释。其既能用于MTB检测，也能用于药物耐药突变检测[26]。2008年，WHO批准LPA用于结核病患者的利福平和异烟肼的耐药性检测。这是WHO最早推荐使用的结核病分子生物学检测技术[27]。有研究统计，对于痰涂片阳性的肺结核患者的痰标本，LPA检测MTB对利福平耐药的敏感度和特异度分别为96.7%和98.8%，检测MTB对异烟肼耐药的敏感度和特异度分别为90.2%和99.2%；但该技术检测痰涂片阴性肺结核患者的痰标本敏感度不高，仅为44%[28]。德国Hain公司推出的第二代LPA技术，在痰涂片阴性肺结核患者的痰标本的检测和二线抗结核药物的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)方面得到了较好的应用。WHO又于2016年推荐其用于二线注射类和氟喹诺酮类抗结核药物的耐药突变检测[29]。Singh等[30]研究显示，对于痰涂片阴性肺结核患者的痰标本，以BACTEC MGIT 960快速培养为标准，第二代LPA检测的敏感度达68.4%。一项Meta分析显示，第二代LPA检测MTB对利福平、异烟肼、二线注射类药物(包括卡那霉素、卷曲霉素、丁胺卡那霉素)、氟喹诺酮类药物的耐药性，以及检测耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的敏感度分别为91%、80%、79%、92%、81%和46%，特异度分别为98%、98%、98%、94%、99%和100%；可见，其检测耐药结核病的准确度较高[31]。但LPA技术的明显缺点是扩增产物进行杂交检测时，手工操作复杂且容易产生污染，因而，限制了其推广和应用[32]。

三、基于基因测序的结核病检测及药物敏感性分析技术

随着现代科学技术的发展，基因测序成为国内外学者研究的热点。与核酸扩增技术和核酸分子杂交等基因检测技术不同，基因测序可提供特定基因的序列信息或完整准确的基因组，因此，也被认为是分子生物学诊断的“金标准”。二代测序技术(next generation sequencing，NGS)又被称为高通量测序，是一种新兴的基于基因序列的病原微生物的鉴定方法。其基本原理是将基因组分割成短片段，对短片段测序再进行拼接，已成功应用于生物体的常规表征[33]、基因分型[34]和结核病的流行病学调查[35]等。已有报道显示，NGS检测肺结核(痰和肺泡灌洗液标本)和肺外结核(脑脊液和脓液标本)均具有较高的敏感度[36-39]。Ko等[40]将NGS应用于MTB耐药基因分析，得到了耐药基因碱基突变情况列表，为今后使用NGS进行MTB耐药基因突变位点检测提供了参考。辜吉秀等[41]研究显示，NGS检测MTB对异烟肼、利福平、氧氟沙星等抗结核药品的耐药性的效能较好，能够满足临床需要。NGS由于具有测序速度快、检测效率高和突变基因检出分辨率高等特点，被临床广泛应用于耐药结核病，特别是MDR-TB的检测。但NGS由于价格高昂、技术要求高和生物信息管道的标准不一等原因在经济欠发达地区和国家的适用性受限[42]。

四、其他新型结核病检测技术

1.Cobas TaqMan MTB：瑞士Roche公司推出的Cobas TaqMan MTB是第一个基于TaqMan qPCR的高通量检测试剂盒。Cobas TaqMan MTB运行在Cobas 8800全自动分子诊断系统上，使用通用的标本准备流程，可在8 h内完成960个样本的高通量检测。Cobas TaqMan MTB在检测呼吸道标本时具有较高的敏感度和特异度，分别为80.8%～88.4%和98.8%～99.4%[43-44]；而检测非呼吸道标本时敏感度较低，仅为63.6%[45]。但该技术在使用N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠(NALC-NaOH)对标本液化、去污和浓缩过程中，导致结果假阴性的可能性较高[46]。

2.BD MAX MDR-TB：BD MAX MDR-TB是一款检测临床标本中MTB，同时检测MTB对利福平和异烟肼耐药性的自动化分子诊断系统[47]。该系统单次最多检测24个样本，手工操作时间短，4 h内可出结果[48]。研究表明，与BACTEC MGIT 960快速培养相比，BD MAX MDR-TB检测痰标本的总体敏感度和特异度为93%和97%；检测涂片阳性和涂片阴性肺结核患者的痰标本的敏感度分别为100%和81%。与药敏试验相比，其检测MTB对利福平耐药性的敏感度和特异度分别为90%和95%，检测MTB对异烟肼耐药性的敏感度和特异度分别为82%和100%[49]。

3．realtime MTB和realtime MTB RIF/INH：以多重qPCR为原理的realtime MTB和realtime MTB RIF/INH检测系统是美国Abbott公司开发的用于检测呼吸道标本的MTB和利福平、异烟肼耐药性的技术，它们的系统是相互独立的，但都依赖高通量m2000全自动系统[50-51]。realtime MTB每批次运行最多可以检测96个标本，检出为阳性的标本继续使用realtime MTB RIF/INH进行耐药性检测，每批次运行最多可以检测24个标本。Kohli等[52]荟萃分析显示，对于呼吸道标本(痰液、肺泡灌洗液等，4858份)，realtime MTB检测MTB的敏感度和特异度分别为96%和97%；realtime MTB RIF/INH检测MTB对利福平耐药性的敏感度和特异度分别为94%和100%，检测MTB对异烟肼耐药性的敏感度和特异度分别为89%和99%。realtime MTB RIF/INH在检测MTB/HIV双重感染患者的痰标本时也具有良好的效能，敏感度在70%以上，特异度可达90%[53]。

五、总结

随着分子生物学检测技术的不断发展，结核病的检出效率明显提高，接受耐药性检测患者的比例也显著提高。但大量涌现的敏感度高、特异度强的分子生物学检测技术并未从根本上改变结核病诊断困难的现状。高昂的检测成本使得这些技术在中低发展水平的国家难以推广，而较大比例的结核病患者恰恰分布在这些国家和地区。因此，相对于一味追求兼具高敏感度、高特异度和自动化全封闭的技术，在全面衡量技术性能和经济可承受性的基础上发展适合医疗条件较差地区的分子生物学检测技术就显得尤为重要。除受到经济条件制约外，这些地区往往很难获得及时的医疗服务，特别是对实验条件要求较高的分子生物学检测服务。因此，不仅要研发低检测成本的高效检测技术，还需发展适合边远地区检测需求的即时检验快速检测系统。