鸡BMPR1B基因克隆、生物信息学及组织表达分析

张晨曦， 赖云强， 杨岚， 樊学伟， 王阳光， 李文婷， 康相涛

(河南农业大学动物科技学院，河南 郑州 450046)

鸡蛋作为蛋鸡产业的主要产品，是人类摄取动物蛋白的主要来源之一，而产蛋量是蛋鸡生产中重要的经济性状[1-2]。蛋鸡繁殖性能与卵巢等器官发育密切相关，直接影响产蛋量[3]，因此，对卵巢发育相关基因克隆及分析将有助于蛋鸡育种工作。目前，中国家禽育种选留工作处于现代分子生物学技术与传统育种手段相结合的阶段[4]，许多研究者通过分子生物学方法发掘相关基因功能，包括基因克隆、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)及分子生物信息学分析等。利用这些技术探究基因结构和功能，将为后续深入研究基因参与调控的生物学机制提供重要理论参考。

卵泡生长发育直接影响产蛋量，受自分泌和旁分泌因子调控。转化生长因子β(transforming growth factorsβ，TGF-β)家族通过自分泌方式作用于颗粒细胞、卵母细胞和卵泡膜细胞，进而调控卵泡发育[5-8]，其家族成员包括骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、生长分化因子(growth differentiation factors，GDFs)、活化素、抑制素等。BMPR1B基因是影响绵羊多羔的主效基因，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性[9]，且该基因所编码的蛋白是多种BMPs的受体，在卵泡发育、生长和免疫等方面扮演重要角色，与动物的繁殖密切相关[10-12]。BMPR1B蛋白与TGF-β家族成员中的BMP15蛋白特异性结合后，形成BMP配体复合物，磷酸化后激活Ⅰ型受体，通过Smad1/5/8磷酸化作用影响颗粒细胞分泌孕酮从而调控卵泡发育，进而影响产蛋率[13-14]。此外，BMP15作为其配体在参与鸡卵泡的选择过程，与鸡的产蛋性状密切相关[15-16]。目前，关于BMP基因以及BMPR1B基因的研究主要集中在羊上，并将其作为多羔候选基因进行探究[17-19]，并判定其主要功能是影响动物卵巢的排卵。然而，BMPR1B基因在家禽中相关研究较少。本研究利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)克隆获得鸡BMPR1B基因cDNA序列，并对该基因进行生物信息学分析，通过qRT-PCR检测鸡BMPR1B基因在各组织中的表达，为BMPR1B基因在分子水平上的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选取43周龄太行鸡(太行鸡保种场)6只，饲养于相同条件下。颈部放血处死后，采集6～8 mm小黄卵泡及整个卵巢组织，同时取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌和腿肌组织，迅速置于液氮中冷冻，之后保存于-80 ℃冰箱备用。试验过程符合动物伦理要求及动物福利法相关规定。

1.2 主要试剂与仪器

TRIzolTMReagent 试剂、DNA Marker、反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；DNase/RNase-free去离子水、2×Taq PCR Master Mix(北京康为世纪生物公司)；DNA 纯化回收试剂盒、pMD18-T 载体、DH5α 感受态细胞、TB Green®Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)、KOD One TM PCR Master Mix(东洋纺(上海)生物科技有限公司)、RACE试剂盒(takara)。

普通PCR 仪(PowerCycle，德国 Eppendorf 公司)；qRT-PCR仪(LightCycler96，瑞士Roche公司)；台式高速离心机(Neofuge 23R，美国 Thermo 公司)；超低温冰箱(MF-U53869，日本Panasonic公司)；电泳仪(DYY-Ⅲ型，上海精宏实验设备有限公司)；凝胶成像系统(GBOX EF，英国 SYNGENE 公司)；分光光度计(NanoDrop 2000，美国Thermo公司)。

1.3 引物设计

根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)上鸡BMPR1B的参考基因序列(NM_205132.1)，使用Primer5.0设计基因克隆特异性引物和荧光定量PCR引物(表1)。引物设计完成后均交由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 BMPR1B基因引物信息Table 1 Primer information of BMPR1B gene

1.4 试验方法

1.4.1 总RNA提取与反转录 利用Trizol法[20]提取组织的总RNA，溶于DNase/RNase-free H2O，通过琼脂凝胶电泳检测RNA完整性，使用NanoDrop 2000分光光度计测定其浓度，并按照反转录试剂盒说明书进行反转得到cDNA，置于-20 ℃冰箱保存，用于后续试验。

1.4.2 鸡BMPR1B基因克隆 以小黄卵泡组织的cDNA为模板，扩增BMPR1B基因的编码序列(coding sequence, CDS)区，扩增体系为：25 μL KOD One TM PCR Master Mix，BMPR1B-F 0.5 μL，BMPR1B-R 0.5 μL，cDNA 1 μL，去离子水补至50 μL。反应程序：98 ℃ 预变形3 min； 98 ℃变性10 s，65 ℃退火5 s，68 ℃延伸10 s，35个循环；68 ℃ 继续延伸5 min。扩增所得产物经DNA纯化试剂盒回收后进行测序。

以测序得到的CDS序列为基础，设计鸡BMPR1B基因5’ RACE与3’ RACE的特异性引物，利用RACE试剂盒克隆其5’端(5’UTR)和3’端(3’UTR)序列。以5’ RACE为例，具体扩增体系：1)一轮巢式PCR：cDNA 2.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，UPM (10×) Primer 5 μL，BMPR1B-5R-521R 1 μL，去离子水补至50 μL，PCR产物稀释50倍；2)二轮巢式PCR: 一轮稀释产物5 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，NEST 1 μL，BMPR1B-5R-337R 1 μL，去离子水补至50 μL，PCR产物稀释50倍；3) 三轮巢式PCR: 一轮稀释产物5 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，NEST 1 μL，BMPR1B-5R-165R 1 μL, 去离子水补至50 μL, PCR产物稀释50倍。反应程序：1)一轮巢式PCR：95 ℃预变形5 min，95 ℃变性30 s，89 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20个循环；95 ℃变性30 s，79 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20个循环；2)二轮巢式PCR：95 ℃预变形5 min；95 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，20个循环；72 ℃继续延伸10 min；3)三轮巢式PCR：95 ℃预变形5 min；95 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20个循环；72 ℃继续延伸10 min。PCR产物纯化后与载体pMD18-T在16 ℃下连接过夜，转化至感受态细胞DH5α中，经菌落PCR验证后，选取阳性片段的克隆送至上海生工生物工程股份有限公司测序。

1.4.3 鸡BMPR1B基因生物信息学分析 利用不同生物信息学软件对鸡BMPR1B基因进行如下分析，主要分为核苷酸序列的同源性比较和进化树构建、蛋白理化参数分析、蛋白结构及功能预测、磷酸化和糖基化位点预测(表2)。

表2 生物学信息分析软件及项目Table 2 Softwares and projects of biological information analysis

1.4.4 鸡BMPR1B基因组织表达分析 以鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胸肌、腿肌和卵巢组织的cDNA为模板，分析鸡BMPR1B基因在各个组织中的表达。qRT-PCR的反应体系：TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ 5 μL，DNase/RNase-free H2O 3 μL，cDNA 1 μL，BMPR1B-F3 0.5 μL，BMPR1B-R3 0.5 μL。反应条件：95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共40个循环，每个待测样本设置3个重复。

1.5 统计与分析

以β-actin作为内参基因，采用2-ΔΔCt法进行分析。另外，通过SPSS22.0软件中单因素方差分析法对其表达量进行显著性检验，P<0.05 表示差异显著，P>0.05 表示差异不显著。数值表示为平均数±标准差，使用 GraphPad Prism8.0 软件作图。

2 结果与分析

2.1 鸡BMPR1B基因的克隆

根据所设计的引物对鸡BMPR1B基因的CDS区进行扩增(图1)，与NCBI上鸡BMPR1B基因的CDS区进行比对，确认所获得的序列为目的基因序列。在所获得的CDS序列基础上，分别进行5’ RACE及3’ RACE。5’ RACE获得扩增条带长260 bp和430 bp左右，3’ RACE获得长度为620 bp左右的扩增条带(图2)。测序分析后，5’ UTR存在2种转录本，长度分别为248和77 bp。3’ UTR存在1种转录本，长度为168 bp。将5’ RACE和3’ RACE结果与CDS序列进行拼接后，得到鸡BMPR1B基因的2种转录本T1和T2，长度分别为1 925和1 754 bp(图3)。转录本T1包括5’ UTR 248 bp，3’ UTR 168 bp，CDS 1 509 bp，转录本T2包括5’ UTR 77 bp，3’ UTR 168 bp，CDS 1 509 bp。

图1 鸡BMPR1B 基因CDS 扩增结果Fig.1 PCR amplification results of chicken BMPR1B gene

图2 鸡BMPR1B基因5’ RACE(左图)、3’ RACE(右图)扩增结果Fig.2 5’RACE(left) and 3’ RACE (right)PCR amplification results of chicken BMPR1B gene

2.2 鸡BMPR1B基因核苷酸同源性分析及进化树构建

鸡BMPR1B基因序列与不同物种比较结果显示，鸡与火鸡、野鸭、大猩猩、家鼠、马、山羊、家猫、牛、人和蛙的BMPR1B基因核苷酸序列同源性分别为99.60%、98.80%、91.63%、91.62%、93.63%、91.04%、86.85%、92.23%、91.43%和90.84%(表3)。进化树分析表明，鸡BMPR1B基因在进化过程中与火鸡亲缘关系最近(图4)。

图3 鸡BMPR1B基因2种转录本Fig.3 Two transcripts of chicken BMPR1B gene

表3 鸡与其他物种BMPR1B基因核苷酸序列比对Table 3 Alignment of BMPR1B gene nucleotide sequence

图4 鸡BMPR1B基因系统进化树

2.3 鸡BMPR1B基因编码蛋白理化性质分析

对鸡BMPR1B基因编码蛋白进行理化性质分析，结果表明，其分子式为C2 505H3 959N691O747S33，包含7 935个原子，相对分子质量为 56.77 ku，理论等电点(pI)为7.51，含有20种氨基酸(表4)。其中，亮氨酸含量最高(9.8%)，色氨酸含量最低(1.4%)。氨基酸不稳定性指数为 53.63，表明该蛋白为不稳定蛋白；蛋白疏水性分析显示，最大值为4.04，最小值为-2.83，平均亲水性为-0.365，则该蛋白为亲水性蛋白(图5)，脂溶性指数为 81.95，表明该蛋白的流动性较好。

表4 鸡BMPR1B基因编码蛋白氨基酸组成Table 4 Amino acid composition of BMPR1B gene encoding protein chicken

2.4 鸡BMPR1B基因编码蛋白结构与功能预测

利用TMHMM在线软件对鸡BMPR1B基因编码蛋白的氨基酸序列进行跨膜结构和信号肽分析。结果表明，该蛋白有1段跨膜结构，无信号肽(图6-A)，属于跨膜蛋白(图6-B)。通过PRABI在线软件预测鸡BMPR1B基因编码蛋白的二级结构，发现有α-螺旋、延伸链、β-转角和无规卷曲4种类型，分别占整个二级结构的35.46%、10.96%、3.39%和50.20%，即无规卷曲是该蛋白的主要结构(图6-C)。使用SWISS-MODEL在线软件预测该蛋白三级结构，发现无规卷曲为鸡BMPR1B蛋白结构的主要组成，与二级结构预测结果一致(图6-D)。利用SMART软件进行蛋白质保守结构域预测，发现该蛋白存在1段跨膜结构域，位于第127～149个氨基酸；1个GS保守结构域，位于第174～204个氨基酸(图6-E)。

图5 鸡BMPR1B基因编码蛋白疏水性分析

注：A：鸡BMPR1B基因编码蛋白信号肽预测：B：鸡BMPR1B基因编码蛋白跨膜结构预测；C：鸡BMPR1B基因编码蛋白二级结构预测；D：鸡BMPR1B基因编码蛋白三级结构预测；E: 鸡BMPR1B基因编码蛋白保守结构域预测。

2.5 鸡BMPR1B基因编码蛋白潜在磷酸化位点和糖基化位点预测

利用NetPhos2.0在线软件预测鸡BMPR1B基因编码蛋白潜在磷酸化位点。结果表明，有1个丝氨酸(Ser)、1个苏氨酸(Thr)和2个酪氨酸(Tyr)可能成为蛋白激酶的磷酸化位点(图7)。使用NETOGlyc3.1在线软件预测糖基化位点，存在2个潜在的糖基化位点(图8)。该结果表明，磷酸化是鸡BMPR1B基因编码蛋白修饰后的主要方式之一。

图7 鸡BMPR1B基因编码蛋白潜在磷酸化位点

图8 鸡BMPR1B基因编码蛋白潜在糖基化位点

2.6 鸡BMPR1B基因组织表达分析

通过qRT-PCR技术检测鸡BMPR1B基因在鸡的心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌和卵巢8个组织的表达情况，结果表明，鸡BMPR1B基因在各个组织中均有表达，以卵巢组织中显著最高(P<0.05)，其次是肝脏、胸肌、肾脏、腿肌，随后是心脏、脾脏(图9)。

注：1.脾脏;2.心脏;3.肺脏;4.腿肌;5.肾脏;6.胸肌;7.肝脏;8.卵巢。不同字母表示差异显著(P<0.05)。

3 结论与讨论

BMPR1B基因通过与其配体结合调节细胞增殖分化，尤其在畜禽繁殖调控中发挥重要作用[21]，被认为是卵泡发育和正常排卵的必要生长因子[22]。本研究从鸡的小黄卵泡组织中成功克隆了鸡BMPR1B基因序列，并获得了2种转录本T1和T2，长度分别为1 925 bp和1 754 bp，编码502个氨基酸。核苷酸序列比对分析发现该基因与火鸡的BMPR1B基因有较高的同源性，并且与火鸡亲缘关系最近，符合生物进化特征。蛋白结构域对其发挥功能起关键作用[23]。本研究发现鸡BMPR1B基因编码蛋白存在1个跨膜区段，无信号肽，属于跨膜蛋白。此外，该蛋白保守结构域分析表明，该蛋白存在单个跨膜区段和1个GS保守结构域，位于第174～204个氨基酸处，该区域高度保守，是TGF-βI型受体活化的重要部位[24]，这与哺乳动物中的研究结果相类似。在哺乳动物中，BMPR1B基因编码蛋白包括N端细胞外结构域、单个跨膜结构域和C端细胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(GS结构域)3部分，其C端的GS结构域是信号传导的重要部位[25-26]。因此，在不同物种中，BMPR1B的信号传导方式可能是相同的。此外，相关研究表明，BMPR1B基因编码的蛋白受体以磷酸化方式活化，之后迅速作用于Smads信号蛋白，形成转录复合物，从而发挥相应的生物学效应[27-28]，这与本研究结果中预测其可能存在Ser、Thr和Tyr共4个磷酸化位点的结果相符合。本研究还发现，鸡BMPR1B基因编码蛋白二级结构主要以无规卷曲为主，占整个二级结构的50.20%；其次是α-螺旋，占35.46%。该结果说明该蛋白稳定性不强。张筱艳[29]在绵羊中发现BMPR1B基因编码蛋白二级结构也是以无规卷曲为主，这与本研究结果类似。一般认为，在二级结构中无规卷曲是造成蛋白不稳定的重要原因，且是蛋白分子功能实施及构象的重要区域。因此，蛋白结构域的预测对正确认识基因的蛋白结构及功能具有重要意义。

基因在不同组织的表达具有广泛性和特异性，其表达受多种因素调控[30]。相关研究发现，BMPR1B基因在动物体内的不同组织内广泛表达[31]，这与本研究结果相一致，即鸡BMPR1B基因在鸡的心、肝、脾、肺和卵巢等8个组织均有表达，且在卵巢表达量最高。卵巢是影响繁殖性状及激素分泌的主要效应器官[32]，其正常发育对家禽排卵非常重要，而本研究中BMPR1B基因在鸡的卵巢中的高表达，说明该基因在卵巢发育中发挥一定作用。在哺乳动物和家禽中，BMP15作为卵母细胞释放的特异性信号因子，通过与受体BMPR1B基因编码蛋白组成 BMP复合物[14]，磷酸化 Smad 蛋白，激活 Smad1/5/8通路[33]，调控下游基因的转录，从而调控卵泡的发育。因此，探究鸡BMPR1B基因的遗传结构和蛋白功能为下一步研究BMPR1B基因在鸡卵巢发育中的功能奠定了遗传信息学基础，对于提高禽类的产蛋性能具有一定的借鉴意义。