施用氮肥对烟草镉积累及其根际细菌群落的影响

张妍妍，杨建涛，李喜凤，张小全，殷全玉，李一伦，郭虹妤，李烜桢

(1.河南农业大学林学院，河南 郑州 450002; 2.河南心连心化学工业集团股份有限公司，河南 新乡 453731; 3.河南农业大学烟草学院，河南 郑州 450002)

近年来，农田土壤重金属污染已成为突出的环境问题[1-2]。中国每年因重金属污染而损失的粮食约1 000万t[3]。据全国土壤污染状况调查公报显示，中国农田土壤污染物点位超标率为19.4%，以重金属污染为主，其中镉的点位超标率为7.0%，为无机污染物中点位超标率最高的重金属[4]。Cd是一种非必需元素，毒性较强，易被植物吸收而通过食物链在人体内积累，对人体造成危害[5-6]。因此，亟待对镉污染土壤进行修复，以保证中国粮食安全生产。目前重金属污染土壤修复方法主要包括物理、化学和生物修复。采用传统物理或化学方法不仅成本高、周期长，而且易造成二次污染，不适合农田重金属污染修复[7]。植物提取技术是修复重金属污染农田的理想方法，但现有的超富集植物一般生物量小，生长缓慢，因此限制了植物修复技术的发展[8]。

烟草是一种具有较强镉富集能力的茄科植物，种植范围广，且具有生物量大、适应性强的特点，尤其对镉耐性较强，可在重度镉污染地区种植[9]。因此，烟草有望成为一种较为理想的镉修复植物[10]。施用活化剂是一种常见的植物修复重金属污染强化方法，但目前常见的活化剂如EDTA、柠檬酸等，不仅成本较高，且容易造成镉的淋溶，污染地下水[11]。虽然添加某些微生物菌剂对提高植物修复镉污染有一定效果，但是微生物在土壤中成活率较低，效果不稳定[12]。因此这些均不是理想的植物提取强化方法。

有研究表明，施用某些氮肥能提高植物对镉污染土壤的修复效果[13]。另外，施肥作为重要的农艺措施，成本较低，同时可提高土壤肥力。但是，氮肥如何影响烟草对镉的提取效率，目前鲜有报道。另外，土壤中具有种类丰富、功能多样的微生物，据统计每克土壤中微生物数量可达几百亿个，而在根际微生物的数量更高[14]。而氮肥如何影响烟草根际微生物群落结构，这些根际微生物又如何影响烟草对镉的富集效果，目前尚无报道。本研究通过比较不同类型肥料对烟草生长和镉富集的影响及其机制，以及施用尿素对根际细菌群落结构的影响，旨在建立烟草修复镉污染的强化措施，为高效、低成本修复镉污染土壤提供技术支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烟草品种为中烟100，由河南农业大学烟草学院提供。供试土壤类型为褐土，采自郑州市北郊农田表层土壤(0～20 cm)。土壤pH值为8.29，总镉含量为0.04 mg·kg-1，有机质含量为12.80 g·kg-1，速效磷含量为6.10 mg·kg-1，速效钾含量为95.50 mg·kg-1，总氮含量为1.50 g·kg-1。

1.2 试验方法

盆栽试验在河南农业大学培养室中进行。向土壤(过2 mm筛)中添加CdCl2粉末(无结晶水)，与土壤充分混合均匀并平衡两周后，测定镉含量为2.10 mg·kg-1。

试验共设置7个处理：对照(CK:施N量为0 mg·kg-1)、硝酸钾(KN1:施N量为20 mg·kg-1，KN2:施N量为26 mg·kg-1)、尿素(CN1:施N量为20 mg·kg-1，CN2:施N量为26 mg·kg-1)、硫酸铵(SN1:施N量为20 mg·kg-1，SN2:施N量为26 mg·kg-1)，每个处理设置3个重复。将土壤分别与不同质量分数及不同形态的氮肥充分混匀，装入盆钵中，每盆装入1 kg土壤。选择生长状况均匀一致的烟苗(四叶一心)移栽至盆钵中置于光照培养室进行培养。每天光照10 h，温度 28 ℃；夜晚14 h，温度18 ℃；湿度为70%。

1.3 样品采集与制备

烟株培养60 d后采集样品，将烟草植株样品用自来水冲洗干净，植物根系再使用20 mol·L-1的EDTA-Na2浸泡15 min，再用去离子水反复冲洗，洗净后晾干表面水分，将叶、茎和根分开并分别装于纸袋，于105 ℃下杀青 30 min，65 ℃烘干至质量恒定。收获植株后，将附着在烟草根系的土壤轻轻抖掉，然后用毛刷将根系表面附着的根际土轻轻刷下，取其中2～3 g土壤样品装入密封袋并作标记，再一并保存至-80 ℃冰箱备用。剩余根际土在清洁干燥的环境中风干，研磨过孔径为2 mm的网，将过筛后的样品标记并编号保存在的自封袋中，待测。

1.4 分析方法

1.4.1 烟草及土壤理化指标测定 土壤 pH值采用pH计(上海雷磁，PHSJ-5)进行测定。土壤有效态镉采用DTPA浸提法，采用原子吸收分光光度计进行测定(日本日立公司，Z-2000)[15]。将烘干后的植物样品用粉碎机粉碎，过孔径为0.15 mm的网，然后采用X射线荧光光谱法-XRF(E-max500)测定植株各部位Cd含量[16]。

Cd提取量=叶Cd质量分数×叶生物量+茎Cd质量分数×茎生物量+根Cd质量分数×根生物量

(1)

转运系数=地上部Cd质量分数/地下部Cd质量分数

(2)

1.4.2 根际细菌16S rRNA的高通量测序 采用CTAB法提取根际土壤总DNA，并使用16S rRNA V4区细菌引物(515F和806R)对目的基因进行PCR扩增，扩增后的目的条带使用胶回收试剂盒回收，采用NovaSeq 6000平台进行16 S rRNA基因序列测定。将得到的有效序列以97%的一致性聚类为OTUs并进行物种注释，基于OTUs水平分析物种相对丰度，多样性指数(香农和辛普森指数)，物种丰度指数(Chao1和ACE指数)和覆盖范围以及基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)。

1.5 数据分析

采用SPSS 22.0进行统计分析，使用Excel 2010以及R语言进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同氮肥对烟草生长的影响

通过分析不同处理烟草生物量发现(图1-A)，对照中烟草植株叶、茎和根生物量分别为1.22、0.36和0.18 g。所有施氮处理均提高了烟草叶生物量，其中KN2处理最为显著，较CK提高了21.3%(P<0.05)，CN1和CN2处理次之；CN1、CN2处理和SN2处理提高了烟草茎生物量，但未达显著效果；KN1处理显著提高烟草根生物量，较CK提高了22.2%，CN1和CN2处理次之。对照中烟草植株高度为16.1 cm(图1-B)，所有施氮处理均提高了烟草植株高度，其中施用CN2对株高的促进作用最大，较对照提高了50.0%。对照中根长度为14.7 cm(图1-C)，不同氮肥处理均提高了烟草根的长度，其中CN2处理促进作用最大，较对照提高了41.9%(P<0.05)。以上结果表明,施用不同氮肥均可促进烟草的生长，其中以尿素处理的效果最好。

注：标有不同小写字母表示同一指标不同处理间差异显著(P<0.05)。下同。A为生物量; B为株高; C为根长。Note：Different lowercase letters indicated that there was significant difference between different treatments in the same index (P<0.05).The same as below.A is the biomass; B is the plant height; C is the root length.

2.2 不同氮肥对烟草中镉含量的影响

通过分析烟草植株叶、茎和根镉含量发现(图2)，对照中烟草叶、茎和根镉含量分别为15.07、9.18和6.54 mg·kg-1。CN1、KN1和CN2处理均显著提高了烟草叶片镉含量，较对照分别提高了50.6%、51.3%和52.6%(P<0.05)，而其他施氮处理虽然也提高了烟草叶片镉含量，但未达到显著水平。另外，所有施氮处理均未显著改变烟草根和茎的镉含量。以上结果表明,施用尿素和硝酸钾在一定程度上均可提高烟草叶片对镉的富集能力。

图2 不同氮肥对烟草镉含量的影响Fig.2 Effects of different nitrogen fertilizers on Cd content in tobacco

通过分析烟草植株对镉的提取量发现(图3)，对照中烟草植株镉的提取量为22.88 μg·pot-1。除施用SN1外，其余施氮处理均显著提高了烟草镉的提取量(P<0.05)。其中，CN1、CN2和KN1处理效果最好，较对照分别提高了63.6%、63.4%和50.58 %。以上结果表明,施用尿素和硝酸钾均可提高烟草对镉的提取效果。

图3 不同氮肥对烟草镉提取量的影响Fig.3 Effects of different nitrogen fertilizers on Cd extraction from tobacco

通过分析转运系数发现(图4)，对照中烟草对镉的转运系数为2.17，所有施氮处理均不同程度地提高了镉的转运系数，其中KN2处理提升作用最大，达到3.58(P<0.05)。其他施氮处理虽然也提高了转运系数，但未达显著水平。这些结果表明,施用硝酸钾有利于烟草植株镉从地下部向地上部的转运。

图4 不同氮肥对烟草镉转运系数的影响Fig.4 Effects of different nitrogen fertilizer on Cd transport coefficient in tobacco

2.3 不同氮肥对根际pH值及有效镉含量的影响

通过分析根际土壤有效镉含量发现(图5)，对照中根际土壤有效镉为1.45 mg·kg-1。所有施氮处理均显著降低土壤有效镉含量，其中CN1和CN2处理较对照分别降低了20.7%和18.6%(P<0.05)，其次为KN1和SN2处理。

图5 不同氮肥对根际有效镉含量的影响Fig.5 Available Cd content in Rhizosphere under different nitrogen fertilizer conditions

通过分析烟草根际pH值发现(图6)，对照中烟草根际pH值为8.28，所有施氮处理均不同程度降低了烟草根际pH值，其中SN1和SN2处理的降低效果最大，较对照分别降低了0.10和0.11个单位(P<0.05)。

图6 不同氮肥对根际pH值的影响Fig.6 Rhizosphere pH under different nitrogen fertilizer conditions

2.4 施用尿素对烟草根际土壤细菌群落的影响

对烟草根际土壤细菌进行16 S rRNA高通量测序发现，CK、CN1和CN2处理测序覆盖率分别达99%、99%和98%，表明测序深度合理，基本能代表样本的真实情况(表1)。通过比较多样性指数发现，CN1处理较对照显著提高了香农指数，表明施用CN1可提高细菌群落多样性；CN1和CN2处理的ACE指数和Chao1指数均较对照显著提高，表明施用尿素均提高了细菌群落的丰富度。而各处理间辛普森指数无显著差异。这些结果表明，施用尿素提高了细菌群落的多样性和丰富度。

表1 尿素对根际土壤细菌群落多样性影响Table.1 Effect of urea on bacteria community diversity in rhizosphere soil

2.5 施用尿素对根际土壤细菌群落的影响

基于Bray-Curtis距离对烟草根际细菌群落进行了PCoA分析(图7)，结果表明,CK、CN1和CN2处理中细菌群落具有明显的分异，表明3个处理对细菌群落具有显著影响。

图7 烟草根际细菌群落结构的PCoA分析Fig.7 PCoA analysis of bacterial community structure in tobacco rhizosphere

通过分析细菌群落结构发现(图8-A)，不同处理细菌群落在门水平上有着相似的分布规律，丰度最大的6个门均为变形菌门(Proteobacteria)、Unidentified_Bacteria、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。与CK相比，CN1处理中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度有所增加，而CN2处理中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度有所下降。另外，施用尿素(CN1和CN2)均使Unidentified_Bacteria、拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度有所增加，而酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度有所减少。

通过分析相对丰度较大的35个属的群落结构发现(图8-B)，相对丰度>1%的菌属分别是酸杆菌门-RB41(Acidobacteria-RB41)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、斯科曼氏菌属(Skermanella)、NMD1、Pontibacter、Bryobacter以及Steroidobcter。与对照相比，酸杆菌门-RB41(Acidobacteria-RB41)、斯科曼氏菌属(Skermanella)、Bryobacter以及Steroi-dobcter在各处理中相对丰度均有所降低，而鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和Pontibacter的相对丰度有所增加。而NMD1在低量尿素中相对丰度较对照有所增加，而在CN2处理中有所减少。在相对丰度排列前35的属中，施用尿素(CN1和CN2)较对照相对丰度提高幅度最大的前3种菌属分别为芽球菌属(Blastococcus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和Pontibacter，分别较对照提高了41.8%～46.9%、20.54%～58.11%以及21.27%～57.47%。

注：A为门水平；B为属水平。Note：A is the phylum level; B is the genus level.

3 结论与讨论

生物量和富集能力均是影响植物提取重金属效果的重要因素[17]。氮素是植物的必需元素，对植物具有重要的生理功能，例如，进行光合作用，合成抗氧化系统、蛋白质以及内源激素等[18-19]。一般来说，施用氮肥可提高植物生物量[20]。本研究发现,不管是硝态氮还是铵态氮均提高了烟草的生物量。这个结果与前人[21-22]研究一致。与此同时，本研究发现氮肥对烟草有较好的促生作用。例如，施用尿素显著提高了烟草植株高度以及根的长度，烟草植株高度提高了50.0%，根长提高了41.9%。

通过分析烟草中重金属含量发现，CK中烟草叶片镉含量(15.07 mg·kg-1)远高于供试土壤中镉含量(2.10 mg·kg-1)。另有研究表明，当土壤中镉含量为8.10 mg·kg-1时，烟草“翠碧1号”中叶片镉含量高达271.26 mg·kg-1[23]，表明烟草对镉具有较强富集能力。此外，有研究表明，超富集植物镉主要积累在地上部，非超富集植物镉主要分布在地下部，而烟草中镉含量也主要分布在地上部，因此烟草对镉的分布规律更接近于超富集植物[24-25]。

根际微生物可直接影响植物对重金属的吸收和利用[36]。尤其对于超积累植物，其根际镉活化菌的丰度往往较高[37]。本研究发现，施用氮肥显著提高了根际细菌群落的香农、Chao1和ACE各项指数，表明施用氮肥可提高根际土壤细菌群落的多样性和丰富度。这可能与施氮增加了土壤氮营养水平，刺激了微生物生长与繁殖有关。其他研究也发现了类似的现象，例如，有学者发现，施用氮肥提高了茶树根际土壤微生物群落多样性[38]。同时也发现，根际土壤细菌群落多样性和丰富度越高，其植株镉提取量也越高。因此认为，施用氮肥可影响根际微生物群落的多样性和丰富度并影响烟草对镉的吸收和利用。

通过分析土壤细菌群落结构变化发现，在门水平上，3个处理丰度最大的前6个门均分别为变形菌门(Proteobacteria)、Unidentified_Bacteria、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，由此可见，施用尿素未显著影响细菌门水平的群落结构。在属水平上，施用尿素使芽球菌属(Blastoco-ccus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和Pontibacter分别较对照相对丰度大幅提升。其中，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)较对照分别提高20.54%～58.11%。有学者也发现施氮条件下会增加鞘氨醇单胞菌等具有促生作用的细菌丰度[39]。

鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)被认为是具有植物促生特性的细菌，其在植物生长、植物耐受逆境胁迫等方面起到重要的作用[40]。因此，施用尿素条件下烟草生物量的提高可能与鞘氨醇单胞菌相对丰度的提高有关。此外，有学者发现，在植物根际施用鞘氨醇单胞菌可促进植物对镉的吸收，其机制是鞘氨醇单胞菌增大了根长、根表面积和根尖数量，以及有机酸的分泌量，这些因素都有利于烟草对镉的吸收和积累[41-42]。因此，在本研究中鞘氨醇单胞菌丰度的提高也可能是使施用尿素促进烟草积累的另一重要原因。

施用尿素、硝酸钾和硫酸铵均提高了镉提取量，其中施用尿素效果最好，对镉的提取量较对照显著提高了63.4%～63.6%。尿素不仅提高了烟草生物量，还提高了植株镉含量。施用尿素可作为烟草修复镉污染土壤的理想强化措施。

施用尿素提高了细菌群落多样性与丰富度，改变了细菌在属水平上的群落结构，显著提高了根际鞘氨醇单胞菌的丰度，这可能是造成烟草镉富集能力增加的重要原因。