稳定同位素指纹分析在蚕茧产地溯源中的应用研究

于海跃 续文婕 周 旸 戴贤君 潘家荣,*

(1 中国计量大学生命科学学院，浙江 杭州 310018；2 中国丝绸博物馆，浙江 杭州 310002)

随着当今社会人民物质水平的逐渐提高和日益丰富，每个国家都越来越注重文化保护研究和文化传承发展。丝绸作为我国古代劳动人民智慧的一项伟大瑰宝，被赋予了特殊的艺术和文化价值，而丝绸的起源问题也被世人聚焦和关注。事实表明，丝绸发源于中国，但当今国际社会仍有一些对这一事实提出的不同看法和反对意见，有些研究学者甚至发表印度丝绸起源论和中亚国家丝绸起源论，并提出所谓新证据[1-2]。因此建立一种蚕丝及相关丝织品的原产地溯源方法体系迫在眉睫。

稳定同位素技术是进行产地溯源较为有效的方法之一。在自然界中，外部环境和生物体不断交换物质组成，由于地理位置、环境、大气条件和生物代谢类型等因素，生物体的同位素组成自然分馏将导致不同环境下不同生物的同位素组成具有差异性，即生物的同位素“指纹”将携带有关生物代谢类型和生物环境因素的信息，从而反映出生物本身的地理环境条件[3-4]。因此，根据生物体这种“自然指纹”，可以利用稳定同位素分析技术测定代谢物质的转移和转变并进行定性定量分析，从而对其产地进行追溯。

在环境分析、水文变迁、食品及药品科学等技术领域中，稳定同位素技术应用广泛，如用于果汁掺假分析[5]、大米产地溯源[6]、蜂蜜掺假鉴别[7]等。近年纺织品产地研究也有应用稳定同位素技术的先例，如Frei等[8-9]测量分析了不同现代产地羊毛中的锶同位素比值，对羊毛纺织物进行了初步产地溯源方法的探究。

自古以来丝绸及相关丝织品主要原材料为养殖桑蚕形成的蚕茧，而喂养桑蚕的食物单一，即只以桑叶为喂食材料，因此桑叶中的同位素会直接传递到蚕，并最终存在于形成的蚕茧中[10]，即在蚕茧上或由蚕茧制成的蚕丝及对应的丝织品中可能会留下特定的同位素特征，形成长久的地理环境标识。因此，在蚕茧产地溯源研究中，最首要的任务是判别和确定不同来源或产地蚕茧中的稳定同位素比值是否有差异，并分析可能产生比值差异的原因。本研究利用稳定同位素技术对4个地区蚕茧中的13C、18O、15N和2H同位素比值进行测定和分析，旨在初步探究利用稳定同位素特征区分不同蚕茧产地的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蚕茧样品分别取自湖北、山东、四川、浙江4个地区，共64份样本，每份样本至少包含10个蚕茧，由中国丝绸博物馆于2019年提供，均已烘干保存。IAEA-CH7、IAEA-600、IAEA-601、IAEA-NO3、V-SMOW、V-PPB都采购自北京瑞利君利科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

MAT-253同位素比质谱仪、Flash HT 2000元素分析仪，美国Thermo Scientific公司；DUG-9 240A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理 每份蚕茧样本选取较为完整无污染的个体5个，放入烘干机设定温度110℃进行烘干干燥，再将每份样本单独剪碎成2 mm×2 mm颗粒，利用研钵持续加入液氮研磨后过筛收集，分类装入2 mL离心管，准备连续测样。

1.3.2 稳定碳氮同位素比值检测方法 称取约0.2 mg待测样品，在超净台用锡杯(4 mm×4 mm×6 mm)包裹后，放置于Flash HT 2000元素分析仪样品盘中，设定标准气体为CO2和N2。氦气吹扫流量设定为200 mL·min-1，燃烧炉温度设定送样温度为恒温960℃，气相色谱柱设定经过温度为恒温50℃，此温度条件下样品中的碳氮元素转化为纯净的CO2和N2，通过氦载气流经水阱，经过恒温50℃的气相色谱柱使其分离，最后进入MAT-253同位素比质谱仪。

1.3.3 稳定氢氧同位素比值检测方法 称取约0.2 mg待测样品，在超净台用银杯(4 mm×4 mm×6 mm)包好后放置于Flash HT 2000元素分析仪样品盘中，设定标准气体为H2和CO。氦气吹扫流量设定为100 mL·min-1，燃烧炉温度设定送样温度为恒温1 380℃，气相色谱柱设定经过温度为恒温50℃，此温度条件下，银杯包裹样品中的氢氧元素在玻璃碳管中经高温裂解反应形成H2和CO，经过恒温50℃的气相色谱柱使其分离，最后进入MAT-253同位素比质谱仪中进行检测。

1.3.4 同位素测量标准 在分析过程中，标样采用国际标样IAEA-CH7、IAEA-600、IAEA-601和IAEA-NO3进行对照和标定，采用两点校正法对样品的测试结果进行校正。为保证结果的准确性，待测蚕茧样品在每种同位素测定时都进行3次重复测样，测量结果取最后的平均值。稳定同位素比率测定公式如下：

δX=(R样品-R标准)/R标准×1 000‰[11]

式中，X分别代表13C、15N、2H、18O等；R相应为13C/12C、15N/14N、2H/H、18O/16O，即测定蚕茧样品的重同位素与轻同位素丰度比。δ2H和δ18O的国际标准参考样品为V-SMOW，δ13C和δ15N的国际标准参考样品为V-PDB[12]。

1.3.5 数据分析与模型建立 利用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析、单指标判别分析、多指标判别分析，利用Fisher线性判别分析建立溯源模型，并验证初始判别率和交叉判别率，采用Origin 2018(IBM)进行相关图像绘制。

2 结果与分析

2.1 不同产地蚕茧的稳定同位素δ13C、δ15N差异

在湖北、山东、四川、浙江4个省份共采集64份样品，其中山东的纬度与其他3个地区相比最高[13]，经度上四川位于最西[14]。

图1 不同产地蚕茧中δ13C和δ15N的值Fig.1 Values of δ13C and δ15N in silkworm cocoons from producing areas

稳定同位素δ13C、δ15N的测定结果如图1所示，4个省份蚕茧的δ13C、δ15N变化范围不同，δ13C的平均值范围为-27.55‰至-24.24‰，δ15N的平均值范围为2.45‰至7.98‰，上述结果显示出了一定的地区差异性。由表2可知，山东蚕茧样品δ13C平均值为-24.91‰， 显著高于其他3个省份，湖北样品δ13C值最低，为-26.57‰；山东样品δ15N值为6.17‰，显著高于其他地区，初步表明基于稳定同位素值(δ13C、δ15N) 判别蚕茧产地具有一定的可行性。

表2 不同产地样品中δ13C、δ15N的显著性差异Table 2 Significant difference of δ13C, δ15N in samples from different producing areas /‰

图2 不同产地蚕茧中δ18O和δ2H的值Fig.2 Values of δ18O and δ2H in silkworm cocoons from different producing areas

2.2 不同产地蚕茧的稳定同位素δ18O、δ2H差异

稳定同位素δ18O、δ2H测定结果如图2所示，4个省份蚕茧的δ18O、δ2H变化范围不同，δ2H的平均值范围为-87.98‰至-54.03‰，δ18O的平均值范围为16.81‰至23.90‰。结果显示出一定的地区差异性，初步表明基于蚕茧的稳定同位素值判别蚕茧产地具有一定可行性。

由表3可知，四川蚕茧样品的δ2H值显著高于湖北和山东，但与浙江蚕茧样品相比不具有显著差异性；湖北、四川、浙江蚕茧样品之间的δ18O具有显著差异性，其中四川蚕茧样品的δ18O值最高，为23.23‰。结果表明不同产地蚕茧样品之间的δ18O、δ2H值具有一定的显著差异性，但不足以完全区分不同原产地蚕茧，需结合多种指标进行原产地溯源研究。

表3 不同产地样品中δ2H和δ18O的显著性差异Table 3 Significant difference of δ2H and δ18O in samples from different producing areas /‰

2.3 基于多同位素指标的蚕茧产地判别分析和溯源模型建立

线性判别分析是一种有监督的模式识别方法[15]，Fisher最早提出线性判别分析等相关概念[16]，这种识别方法通过建立样品的判别函数对判定样本进行分类[17]。将蚕茧样本的同位素测量结果作为原始数据，对产地进行判别分析，采用Fisher函数线性判别并利用逐步判别法将样本按地区分组建模，并利用留一法进行交叉检验验证。由表4可知，随着同位素指标的逐渐加入，初始判别率和交叉判别正确率得到了明显提升。

表4 多个同位素指标组合对蚕茧产地判别的准确率Table 4 Accuracy of multiple isotope index combinations to distinguish the origin of silkworm cocoons /%

表5 判别分类得分表Table 5 Discriminant classification score table

最后选择采用δ13C、δ18O、δ15N、δ2H建立蚕茧产地溯源模型，表5是溯源模型的判别得分表，最后溯源模型的初始判别率和交叉判别正确率分别为84.5%和77.6%。判别函数分别为：Y(湖北)=-1 746.21-115.79δ13C+13.33δ15N+0.17δ2H+18.05δ18O，Y(山东)=-1 589.42-108.99δ13C+13.69δ15N-0.03δ2H+18.16δ18O，Y(四川)=-1 762.93-115.36δ13C+12.51δ15N+0.31δ2H+19.95δ18O，Y(浙江)=-1 748.46-115.44δ13C+13.22δ15N+0.217δ2H+18.79δ18O，在蚕茧产地溯源的实际应用中，根据所建立的溯源判别模型可对上述4个地区的盲样进行判别分类。将仪器测定的4种稳定同位素值即δ13C、δ18O、δ15N和δ2H对应代入溯源模型中，盲样归属于对应的Y值最大的地区[18]。

3 讨论

近年来，同位素技术逐渐应用于产地溯源和追踪研究等领域，如水果产地溯源中采用稳定同位素技术鉴别库尔勒香梨产地[19]；粮油产地溯源中基于稳定氢氧同位素鉴别花生油掺假[20]；中草药产地溯源中采用稳定同位素技术对竹节参进行产地溯源[21]和环境污染追踪中利用氮氧同位素解析水体中硝酸盐污染来源[22]等。在溯源研究中，4种稳定同位素测定值受外界人为因素的干扰较小，其丰度主要与当地的地理环境、大气状态、温度和水文等密切相关[23-25]，进而稳定同位素特征能够体现出当地的地理环境特征。因此，本试验通过测定不同地区的蚕茧中δ13C、δ18O、δ15N和δ2H 4种同位素丰度，利用单因素方差分析、多重比较分析、Fisher线性判别分析留一法交叉验证，最后建立蚕茧产地溯源模型来区分试验地区的蚕茧。

蚕茧中稳定同位素比率的测定结果显示，不同产地蚕茧中的δ13C、δ18O、δ15N和δ2H同位素丰度均存在一定的显著性差异。这与前人判定四川和浙江桑叶同位素δ13C、δ18O、和δ2H值存在差异[26]的结果一致。蚕茧中的碳元素主要来源于蚕食用的桑叶，而桑叶中的碳元素主要由光合作用合成，其受到大气状态、光照时间、温度情况等外部地理环境因素的影响。各产区的温度情况不同导致桑叶生长中碳同位素分馏，在进行蚕的喂食之后，进而影响蚕茧样品的重同位素与轻同位素比值，因此导致各地区蚕茧样本中δ13C的平均值具有一定差异。

随着外界环境变化，植物本身的物候期也发生相应变化，在利用水分来源上存在着较大的时空差异，大气降水、温度、空气湿度、土壤水分等环境因子影响着植物稳定同位素组成[26-27]。研究表明，植物样品的δ18O、δ2H值随纬度变化而变化，随着海拔上升而降低，存在一定的纬度效应和海拔效应[28]。本研究中，山东的纬度与其他3个地区相比具有较大差异，为最高纬度的采样区域，从同位素测量结果可以看出，山东产区样品的δ18O处于较低水平、δ2H低于其他3个产区，这在一定程度验证了海拔效应和纬度效应对重同位素与轻同位素比值的影响。

动物中的δ15N值主要受土壤状况、气候变化及农业施肥活动等地理环境因素的影响[29]。研究表明，施用有机肥可提高土壤和植物中氮含量，而施用化肥则降低土壤与植物中氮含量[30]。本研究中，山东产区蚕茧样品的δ15N值显著高于其他3个地区，这一现象可能与当地过去的农业活动和土壤施肥情况有关。

从气候角度分析，低纬度到高纬度的变化会导致温度降低，降水中的重同位素也逐渐贫化[31]。从地理环境角度分析，四川盆地的地形作用使得盆地区域内高温、高湿，近地面层贴地逆温加强[32]，一定程度上导致四川蚕茧样品的δ2H值相对较高。因此，在分析同位素含量差异时要充分考虑地形与气候所造成的影响。

同位素特征可能会从桑叶传递到蚕茧，在蚕茧中留下特定的同位素特征。因此从目前的研究结果来看，用不同产地桑蚕茧制成的丝绸中，其稳定同位素特征信息也可能不同。而本研究中，逐步线性模型的总体判别准确率为84.5%，说明此模型比较适于蚕茧产地溯源。

4 结论

本研究采用稳定同位素比率质谱仪测定浙江、湖北、四川、山东4个产地蚕茧中的稳定同位素δ13C、δ18O、δ15N和δ2H值。结合单因素方差分析、逐步判别分析和Fisher线性判别分析等统计学判别分析手段，结果表明通过δ13C、δ18O、δ15N和δ2H这4个指标进行判别分析并建立蚕茧产地溯源模型，判别模型的初始判别准确率达到84.5%，交叉验证判别率达到77.6%，可对4个产地的蚕茧样品进行比较有效地判别区分，适于进行蚕茧产地溯源。