利用分子标记辅助选择Pigm-1基因改良恢复系R20的稻瘟病抗性

何旎清 杨德卫 郑向华 黄凤凰 程朝平 叶 宁

(福建省农业科学院水稻研究所, 福建 福州 350018)

由稻瘟病菌引起的稻瘟病是一种世界性病害[1]，也是我国水稻新品种审定中实行“一票否决制”的水稻病害，近年来其危害性和蔓延面积呈不断上升的趋势。稻瘟病不仅会引起水稻大幅减产(10%～35%)[2]，严重时甚至颗粒无收[3]，而且能影响稻米品质。国内外研究者利用不同的研究方法和不同的遗传定位群体，已鉴定了500多个稻瘟病相关基因，这些基因分别位于水稻12条不同的染色体上[2]。其中，研究者利用图位克隆等方法，已从水稻中克隆了Pit、Pi2、Pi9、Piz-t、Pigm、Pib和Pita等25个稻瘟病抗性R基因[2]。

谷梅4号是起源于我国农家品种的育种材料。近期，何祖华研究团队从起源于我国农家品种的育种材料谷梅4号中鉴定了1个广谱持久的抗瘟性新位点Pigm[3]。Pigm是包含多个NBS-LRR(nucleotide binding site-leucine rich repeat)类抗病基因的基因簇，含有PigmR和PigmS，PigmR表达导致水稻千粒重降低、产量下降；与PigmR相反，PigmS受表观遗传的调控，仅在水稻花粉中特异高表达，从而提高水稻的结实率，抵消PigmR对产量的影响[3]。进一步研究表明新型转录因子PIBP1与PigmR以及其他类似的抗病蛋白Pizt、Pi9特异性互作，促进自身细胞核蛋白的累积，从而激活下游防御反应[4]。本研究前期利用图位克隆的方法，从双抗77009中克隆了一广谱抗稻瘟病基因Pigm-1，Pigm-1包含Pigm-1R和Pigm-1S，Pigm-1S与PigmS序列完全一样，而Pigm-1R与PigmR存在3个碱基的差异，是Pigm新的等位基因；抗性鉴定表明Pigm-1对来自我国不同稻作区的多个稻瘟病生理小种均表现抗病性[5]。

目前防治稻瘟病最有效、最经济、最根本的方法是选育和推广抗病品种[3]，而广谱抗病R基因介导的抗性高效且可操作性强。利用广谱、抗性持久的抗稻瘟病R基因，结合分子标记辅助选择技术，是培育抗稻瘟病水稻品种最有效的手段之一。目前已有利用分子标记辅助技术将水稻抗病基因转入水稻材料的报道，倪大虎等[6]利用分子标记技术将抗稻瘟病基因Pi9和抗白叶枯基因Xa21和Xa23同时聚合到了水稻中；Jiang等[7]应用分子标记辅助选择技术，育成了同时携带Pi1和Pi2的不育系金23A；赵国超等[8]利用分子标记辅助选择技术，育成了同时携带Pi9、Pita、Pib和Pigm基因的两系不育系2179S。

水稻三系恢复系R20是福建省农业科学院水稻研究所种质创制研究室通过常规杂交技术育成的优质籼型恢复系，但其稻瘟病抗性弱。在满足高产、优质和广适应性等育种目标的基础上，提高水稻品种的稻瘟病抗性水平，已成为广大水稻育种追求的目标。鉴于此，本研究以双抗77009 为抗性基因Pigm-1的供体亲本，以感病恢复系R20为受体亲本，通过杂交与回交的方法，并利用Pigm-1基因的功能分子标记，开展分子标记辅助选择育种实践，定向改良优质水稻恢复系R20的稻瘟病抗性，旨在为稻瘟病抗稻瘟病基因Pigm-1的分子育种研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供体Pigm-1亲本：双抗77009为福建省农业科学院水稻研究所种资资源研究室保存的一个抗性品种，在安徽省黄山、福建省上杭、江西省井冈山和湖北省宜昌均表现出较强的稻瘟病抗性[5]。受体亲本：R20是福建省农业科学院水稻研究所种质创制研究室通过常规杂交技术育成的优质籼型恢复系。

1.2 抗性鉴定

室内稻瘟病抗性鉴定：接菌参照Yang等[5]的方法，并进行适当修改。将带有Guy11孢子的滤纸片放置到完全(complete medium, CM)培养基中，然后置于28℃恒温培养箱中，培养一周后，转接到米糠培养基中，在28℃恒温培养箱培养，直到菌丝长满培养基，将菌丝轻轻刮去，放于28℃光照培养箱中进行产孢。5～7 d后将孢子刮下，并用0.2%的Tween-20将孢子浓度调整为1×105个·mL-1，均匀地喷雾到生长15 d左右的水稻叶片表面，将喷菌后的幼苗放置在26℃条件下黑暗培养24 h，转移至长日照接菌室6～7 d后统计发病表型。

田间稻瘟病抗性表型鉴定：受体亲本R20和改良系R20-1、R20-2、R20-3和R20-4经室内催芽后于2020年5月18日播种于福建省上杭县茶地乡农技站天然病圃，期间进行常规管理，不打农药。同年6月5日对每个株系进行苗期稻瘟病抗性调查和统计。

1.3 稻瘟病抗性基因Pigm-1的功能标记

抗性基因Pigm-1的功能标记参考Yang等[5]开发的标记Pigm-1F: T T A T T T C G T T T G C T A T G C; Pigm-1R: G G A C T A T G T G A T C G G T T A。

1.4 性状调查

2020年7月，将供试材料种植于福建省农业科学院水稻研究所实验农场。双抗77009、R20、R20-1、R20-2、 R20-3和R20-4分别种植1个小区，每个小区种植3行，每行种20 株，每个小区设置 3个重复，常规管理。

水稻株高、穗长和分蘖数等相关性状的调查和分析参考Yang等[9]的方法；稻谷粒长和粒宽等测定参照Tan等[10]的方法。

1.5 水稻DNA的提取及电泳检测

水稻叶片DNA提取、样品PCR扩增以及扩增产物检测分析参照杨德卫等[11]的方法。

1.6 改良恢复系R20稻瘟病抗性方法

以亲本R20为母本，抗稻瘟病亲本双抗77009为父本，杂交后，再以R20为回轮亲本进行回交，回交过程中跟踪分子标记。

2 结果与分析

2.1 双亲水稻的稻瘟病抗性分析

本研究利用稻瘟病菌Guy11对双抗77009和R20进行室内稻瘟病接种，结果表明双抗77009表现抗病，R20表现感病(图1)。

2.2 利用分子标记改良恢复系R20的稻瘟病抗性

为了改良恢复系R20稻瘟病抗性，本研究以受体亲本R20为母本，以供体亲本双抗77009为父本进行杂交，接着用亲本R20为父本进行连续回交，回交过程中跟踪分子标记，选择含有Pigm-1基因的单株为母本继续回交，直到BC3F1，后再自交得到BC3F2，继续跟踪分子标记，并综合农艺性状，获得8份含有Pigm-1基因的单株，将这些单株连续种植两代并跟踪分子标记，在综合株高、抽穗期和结实率等相关农艺性状情况下，最终获得4份农艺性状优良与R20性状相似的稳定材料，分别命名为R20-1、R20-2、R20-3和R20-4，分子标记检测均含有稻瘟病抗性基因Pigm-1。

图1 双抗77009和R20室内接种稻瘟菌Guy11抗性表现Fig.1 Resistance performance of Shuangkang77009and R20 with rice blast fungus Guy11

2.3 改良恢复系的稻瘟病抗性鉴定分析

室内抗性鉴定结果表明，4份改良系均表现出抗病(图2-A)。进一步在自然条件下进行抗性鉴定。结果表明对照亲本R20表现出感病，4份改良系均表现出抗病(图2-B)。

图2 受体亲本R20与4个改良系室内接菌(A)和田间抗性鉴定(B)比较Fig.2 Comparison of indoor inoculation (A) and field resistance identification (B) between R20 and four improved lines

2.4 改良恢复系的主要农艺性状分析

对4份改良系和受体亲本R20在成熟期进行农艺性状调查。结果表明，受体亲本R20与R20-1、R20-2、 R20-3相比，其株高、穗长、有效穗、每穗颖花数、结实率、粒长、粒宽和千粒重等性状无显著差异(表1)；R20与R20-4相比，株高、穗长、有效穗、每穗颖花数、结实率和粒宽等性状无显著差异，而粒长(图3)和千粒重表现出极显著差异(表1)。

表1 受体亲本R20与4个改良系株高、穗长和千粒重等主要农艺性状比较Table 1 Comparison of main agronomic traits for plant height, panicle length and thousand seeds weight between R20 and four improved lines

2.5 改良恢复系遗传背景分析

利用 326 对均匀分布于水稻12条染色体上的SSR标记对双抗77009和R20两个亲本进行多态性分析，结果表明有89对SSR引物在双亲之间能检测多态性。利用这89对SSR引物对R20-1、R20-2、R20-3 和R20-4这4个稳定的纯合材料进行遗传背景检测，结果如图4所示。株系R20-1在第1号染色体上的标记RM5496为纯合基因型，在第6号染色体上的标记RM3498为杂合基因型；株系R20-2在第3号染色体上的标记RM6832为纯合基因型，在第8号染色体上的标记RM3496为纯合基因型；株系R20-3在第7号染色体上的标记RM11为纯合基因型；株系R20-4 在第1号染色体上的标记RM5496为纯合基因型，在第12号染色体上的标记RM17为纯合基因型。这4个株系都基本恢复了受体亲本的背景，其中有3个株系含有供体的2个片段，有1个株系含有供体的1个片段。

图3 受体亲本R20与改良系R20-4的粒长差异比较Fig.3 Comparison of main agronomic traits for grain length between R20 and R20-4

图4 4个改良系遗传背景分析Fig.4 Genetic background analysis of four improved lines

3 讨论

水稻稻瘟病是水稻的重要病害之一，给我国甚至全世界水稻的安全生产带来了巨大隐患[12-14]。传统水稻抗病育种是通过接种或在发病区进行抗性鉴定等方式，然后通过人工表型选择，再进行抗性鉴定，工作量大、耗时；同时受外界环境影响大，鉴定不准确，导致抗性选择的效率低。而利用抗性基因的功能标记，再借助于分子标记辅助选择技术，可以减少或消除这些不利因素，是培育水稻抗病品种的最有效途径之一[15]。

抗性基因常常与不良性状紧密连锁，尽管目前利用分子标记辅助选择抗稻瘟病基因来改良水稻稻瘟病抗性的研究已取得一定进展，但存在无法同时保证产量的缺点[16-17]。例如刘文强等[18]研究表明Pi25(t)与水稻结实率和每穗实粒数等性状之间存在连锁累赘；向小娇等[19]研究表明pi21可能与水稻产量性状之间存在连锁累赘；Zhou等[20]研究表明Pi2与水稻抽穗期Hd1紧密连锁，导入Pi2后水稻抽穗期将推迟；Patroti等[21]研究表明Pi1、Pi2和Pi54与不良性状的连锁阻力在0.2～2 Mb之间。本研究利用前期克隆广谱抗稻瘟病基因Pigm-1[5]， 通过分子标记辅助选择技术，获得4份稳定的R20抗稻瘟病改良系，除了株系R20-4外，其余株系农艺性状与受体亲本均无显著差异。进一步分析发现，改良系R20-4除表现抗稻瘟病外，其粒长和千粒重均显著高于受体亲本R20。综上所述，本研究不仅获得了抗稻瘟病的改良系R20-1、R20-2和R20-3，还获得了抗病和产量均得到提高的改良系R20-4。此外，大部分已鉴定和克隆的稻瘟病抗性基因抗谱较窄，难以应用于水稻抗病育种实践[3，22-23]，且长期使用单一类别的稻瘟病抗性基因，会促进稻瘟病菌产生新的优势生理小种，导致原有抗病基因效果减弱或完全失效[24]。本研究利用的抗病基因Pigm-1具有良好的广谱抗病性[5]，可用于丰富抗病基因资源。由此可知，稻瘟病抗性基因Pigm-1在水稻抗稻瘟病育种方面可能具有良好的应用前景。

分子标记辅助选择技术是作物遗传改良应用最广泛的技术之一，对作物分子育种具有极其重要的作用[25]。在育种研究中，可以根据育种材料的实际情况，利用新技术、新方法及种业体制改革和品种审定的多元化条件，对分子标记辅助育种技术进行适当的调整，其中供体亲本是分子标记辅助育种的核心。但利用常规杂交法将有利基因从野生稻等原始材料中转入改良品种耗时较长，同时存在杂种不育、与不利性状基因连锁及株叶形态不理想等问题[26-27]。例如，前期水稻优异基因的挖掘和利用课题组通过构建近等基因系，将漳浦野生稻中qHD19导入到栽培稻中，虽然获得了相对理想的水稻新材料，但耗时近4～5年[9, 28]。因此，开发有利基因的功能标记，利用分子标记辅助法筛选含有目标基因且在生产上应用广泛的水稻材料作为供体亲本，以待改良的材料作为受体亲本，通过杂交定向改良水稻品种的目标性状，将解决野生稻等原始材料的优良基因难以利用的困扰。Pigm是从谷梅4号中克隆的水稻广谱抗稻瘟病基因[3]，但谷梅4号是地方籼稻品种，农艺性状一般，且与粳稻杂交亲和力差、后代分离大，直接利用谷梅4号进行改良育种较难[27]。在后续研究中发现，广泛应用于生产的三系不育系谷丰A中也含有Pigm基因。因此，谷丰A比谷梅4号更适用于水稻育种研究。利用谷丰A或其对应的保持系谷丰B来改良相应的不育系和保持系，将有效缩短育种进程、提高育种效率。本研究选择不良性状少且生产利用率高的双抗77009作为供体亲本，以应用广泛的优质恢复系R20为母本，在较短时间内获得了改良的抗病恢复系材料，大大缩短了育种时间，节约了育种成本。

4 结论

本研究以双抗77009 为抗性基因Pigm-1的供体亲本，感病恢复系R20为受体亲本，通过杂交和回交，并借助于分子标记辅助选择技术，定向改良优质水稻恢复系R20的稻瘟病抗性，得到了4个R20的抗病近改良系，这4个改良系均表现抗病。进一步农艺性状分析表明，改良系R20-4的粒长和千粒重与R20存在极显著差异。本研究利用分子标记辅助技术，改良了恢复系R20的稻瘟病抗性，并发现改良系R20-4在抗病的同时产量有所提高。