葛花异黄酮精制及体外降脂活性研究

吴 威

李 群

宋 笛

孙明哲

(长春职业技术学院食品与生物技术分院，吉林 长春 130033)

葛花(Puerariaeflos)又名葛条花，具有解酒、降血脂、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性[1-3]。葛花异黄酮是葛花的主要生物活性成分之一[4]，近年来葛花异黄酮的提取、纯化和结构鉴定方面也取得一些研究成果[5-7]，但分离纯化技术落后、产品纯度不高限制了葛花异黄酮在食品、化妆品和医药健康领域的应用。

肥胖已成为世界性的健康问题，脂类过量摄入是导致超重的重要因素之一。抑制膳食脂肪吸收进入人体消化系统是减肥的重要途径之一[8]。在脂肪消化吸收过程中胰脂肪酶和胆固醇酯酶发挥了关键作用，抑制胰脂肪酶和胆固醇酯酶活性，可控制脂肪吸收进入人体，因此，胰脂肪酶抑制率、胆固醇酯酶抑制率和胆固醇胶束溶解度成为体外降脂减肥评价的通用方法[9-11]。异黄酮类化合物具有一定的降脂活性[12]，但关于葛花异黄酮降脂活性的研究未见报道。研究拟优化葛花异黄酮精制工艺，并以胰脂肪酶、胆固醇酯酶和胆固醇胶束溶解度抑制率为指标，评价精制前后葛花异黄酮的体外降脂减肥活性，以期为葛花资源在食品领域中的应用提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

葛花：吉林大药房，经干燥、粉碎、过80目筛备用。

1.2 仪器与试剂

酶标仪：F50型，瑞士帝肯TECAN集团公司；

紫外可见光分光光度计：UV-1700型，日本岛津公司；

真空冷冻干燥机：FD-1A-50型，上海豫明仪器有限公司；

气流式超微粉碎机：RT-25型，北京锟捷玉诚机械设备有限公司；

超声波萃取仪：KS-600N型，上海柯祁仪器设备有限公司；

旋转蒸发仪：RE-52C型，巩义市予华仪器有限责任公司；

葛根素标准品：中国食品药品检定研究院；

AB-8、NKA-9、HPD-100、D101、LSA-10型大孔树脂：天津允开树脂科技有限公司；

猪胰脂肪酶(100 U/mg)、猪胰胆固醇酯酶(100 U/mg)、对硝基苯基月桂酸酯、对硝基苯基丁酸酯：美国Sigma公司；

奥利司他胶囊(orlistat)：重庆华森制药有限公司；

总胆固醇检测试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司。

1.3 葛花异黄酮提取方法

参照孙明哲[13]的方法，以葛花为原料，粉碎过80目，固液比(m葛花∶V乙醇溶液)1∶16 (g/mL)，乙醇体积分数74%，超声功率260 W，超声时间40 min，超声温度76 ℃，提取2次，浓缩、冻干(-55 ℃，0～5 Pa)备用。

1.4 葛花异黄酮的精制工艺

1.4.1 葛花异黄酮吸附率和解吸率 吸附率按式(1)计算，解吸率按式(2)计算。

(1)

(2)

式中：

A——吸附率，%；

D——解吸率，%；

A0——原液葛花异黄酮的吸光度值(250 nm)；

A1——吸附后溶液的吸光度值(250 nm)；

A2——洗脱溶液的吸光度值(250 nm)。

1.4.2 树脂优选 分别取5 g AB-8、NKA-9、D101、HPD-100和LSA-10型大孔吸附树脂，预处理后置于三角瓶中，分别加入 50 mg/mL的葛花异黄酮粗提液20 mL，室温震荡2 h，过滤，于250 nm处测定滤液的吸光度值，计算吸附率；取吸附饱和的树脂，分别向其中加入体积分数70%的乙醇水溶液20 mL，室温条件下振荡2 h，过滤，测定250 nm处吸光度值，计算解吸率，葛花异黄酮的精制树脂选择吸附率和解吸率中的最大值。

1.4.3 葛花异黄酮质量浓度对吸附率的影响 取质量浓度12.5，25，50，100，200，400，800 mg/mL的葛花异黄酮溶液各50 mL，与20 g预处理的HPD-100型大孔树脂混合，室温振荡 2 h，过滤，测定滤液的吸光度值(250 nm)，计算吸附率。

1.4.4 pH值对葛花异黄酮吸附率的影响 三角瓶中分别配制50 mL质量浓度为50.0 mg/mL的葛花异黄酮，pH值分别调整为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，分别加入预处理的HPD-100型大孔树脂20 g，室温振荡 2 h，过滤，测定滤液的吸光度值(250 nm)，计算吸附率。

1.4.5 洗脱液体积分数对葛花异黄酮解吸率的影响 分别配制50 mL体积分数为30%，40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液，加入吸附饱和的HPD-100型大孔树脂20 g，室温振荡 2 h，过滤，测定滤液的吸光度值(250 nm)，计算解吸率。

1.4.6 pH值对葛花异黄酮解吸率的影响 取吸附饱和的HPD-100型大孔树脂20 g 于三角瓶中，将50 mL体积分数70%的乙醇溶液分别加入其中，调整溶液的pH值分别为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，置于摇床中振荡 2 h，过滤取滤液，测定250 nm处吸光度值，计算解吸率。

1.4.7 洗脱流速对葛花异黄酮解吸率的影响 层析柱中(35 mm×500 mm)填入HPD-100型大孔树脂(经预处理)，经12 h平衡后，上样，即加入20 mL葛花异黄酮溶液(100 mg/mL)；洗脱，即利用70%(pH 5.0)乙醇溶液进行洗脱，洗脱流量分别调整为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL/min，收集洗脱液，测定滤液的吸光度值(250 nm)，计算解吸率。

1.5 葛花异黄酮对胰脂肪酶活性的影响

胰脂肪酶活性测定参照Gondoin等[14]的方法并做适当修改。酶液(10 mg/mL)：1 g胰脂肪酶溶解于10 mL去离子水中，涡旋2 min，离心(8 000 r/min，10 min)取上清液备用；缓冲溶液：100 mmol/L pH 8.2 的三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris)；底物(对硝基苯基月桂酸酯0.08%)：以5 mmol/L pH 5.0的磷酸盐缓冲溶液(内含1% 曲拉通，Triton X-100)配制。分别取缓冲溶液350 μL，酶液150 μL，不同质量分数葛花异黄酮样品50 μL于离心管中，再加入450 μL底物开始反应，37 ℃孵育2 h，离心(8 000 r/min，1 min)，测上清液吸光度值(400 nm)，对照组以去离子水替代葛花异黄酮，胰脂肪酶抑制率按式(3)计算。

(3)

式中：

HP——胰脂肪酶抑制率，%；

AC——对照组吸光度值；

AS——样品吸光度值。

1.6 葛花异黄酮对胆固醇酯酶活性的影响

胆固醇酯酶活性测定参照Garzón等[15]的方法并适当修改。酶液(25 μg/mL)：0.25 mg猪胰胆固醇酯酶溶解于10 mL去离子水中，离心(8 000 r/min，10 min)取上清液备用；底物缓冲液：配制0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液(pH 7.04)(内含0.1 mol/L NaCl，0.02 mol/L对硝基苯基丁酸酯，6 mmol/L牛磺胆酸钠)，分别取底物缓冲液925 μL，酶液50 μL和25 μL不同质量分数葛花异黄酮样品于离心管中，25 ℃孵育5 min，测吸光度值(405 nm)，对照组加入25 μL去离子水，胆固醇酯酶抑制率按式(3)计算。

1.7 葛花异黄酮对胆固醇胶束溶解度的影响

胆固醇胶束的制备参照Prados等[16]的方法并适当修改。胆固醇胶束制备：以15 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)配制，内含牛磺胆酸钠(10 mmol/L)、胆固醇(2 mmol/L)、油酸(5 mmol/L)、NaCl(132 mmol/L)，超声波(400 Hz)处理1 h，37 ℃孵育24 h，取1 mL不同质量分数葛花异黄酮样品与5 mL胆固醇胶束混合，37 ℃孵育2 h，离心(8 000 r/min，10 min)，用总胆固醇试剂盒测定上清液胆固醇含量，对照组加1 mL去离子水，抑制率按式(4)计算。

(4)

式中：

HC——胆固醇胶束溶解度抑制率，%；

CC——对照组胆固醇含量，mmol/L；

CS——样品胆固醇含量，mmol/L。

1.8 数据处理

2 结果与分析

2.1 葛花异黄酮精制工艺的确定

2.1.1 树脂优化 大孔吸附树脂是广泛选用的精制异黄酮类化合物的柱填料，因其极性和粒径大小的不同，对不同异黄酮类化合物的吸附和解离的难易程度存在差异[17]。由图1可知，HPD-100型大孔树脂对葛花异黄酮表现出较好的吸附和解离性能，吸附率最高为89.61%，解吸率最高为83.86%，优于其他类型的大孔树脂，HPD-100型大孔树脂的极性和粒径适合分离葛花异黄酮，可以用于后续精制过程。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图1 树脂筛选Figure 1 Optimization of macroporous adsorption resin

2.1.2 葛花异黄酮质量浓度对吸附率的影响 由图2可知，随着葛花异黄酮质量浓度的增大，吸附率呈先增加后减小的趋势，当葛花异黄酮质量浓度达到100 mg/mL时，吸附率出现最大值88.41%，此后吸附率逐渐减小。可能是高浓度的葛花异黄酮堵塞树脂孔洞，导致吸附率下降，因此葛花异黄酮吸附液质量浓度定为100 mg/mL。

2.1.3 pH值对葛花异黄酮吸附率的影响 由图3可知，随吸附溶液pH的增加，吸附率呈先增大后减小的趋势，当吸附液pH为6.0时，吸附率最高为87.49%。葛花异黄酮的弱酸性质使其在pH 6.0 时出现最高的吸附率，与闵玉涛等[18]纯化葛根异黄酮的吸附溶液pH(5.0～6.0)相似。因此，调整吸附溶液pH为6.0。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图2 葛花异黄酮质量浓度对吸附率的影响

字母不同表示差异显著(P<0.05)图3 pH值对葛花异黄酮吸附率的影响Figure 3 The effect of pH on adsorption rate ofPuerariae flos isoflavones

2.1.4 洗脱液体积分数对葛花异黄酮解吸率的影响 由图4可知，随洗脱液浓度的增加，解吸率呈先增大后减小的趋势，当洗脱液体积分数为70%时，解吸率达到最大值82.35%，70%的乙醇溶液，其极性适合从树脂上解离葛花异黄酮类物质。因此，洗脱溶液定为体积分数70%的乙醇溶液。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图4 洗脱液体积分数对葛花异黄酮解吸率的影响

2.1.5 pH值对葛花异黄酮解吸率的影响 由图5可知，随洗脱溶液pH值的增大，解吸率先增大后减小，在pH值为5.0处，解吸率出现最大值81.52%，因此，洗脱液pH值调整为5.0。

2.1.6 洗脱流速对葛花异黄酮解吸率的影响 由图6可知，随洗脱流速的增加，葛花异黄酮解吸率呈先增大后减小的趋势，当2.0 mL/min速度进行洗脱时，解吸率出现最大值82.35%，洗脱流速过高，葛花异黄酮洗脱不够完全，导致解吸率减小，洗脱流速参数与刘莹等[19]的结论相同。因此，洗脱流速调整为2.0 mL/min。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图5 pH对葛花异黄酮解吸率的影响

字母不同表示差异显著(P<0.05)图6 洗脱流速对葛花异黄酮解吸率的影响

2.1.7 葛花异黄酮精制工艺参数 层析柱中(35 mm×500 mm)装入预处理的HPD-100型大孔树脂，以去离子水平衡12 h，吸附条件：葛花异黄酮质量浓度100 mg/mL，pH 6.0，体积20 mL；解吸条件：70%乙醇溶液(pH 5.0)，流速2.0 mL/min。如图7所示，经HPD-100型大孔树脂精制后，洗脱曲线中出现单一组分峰，收集管编号(22～30)，真空浓缩，冷冻干燥后获得葛花异黄酮精制组分A1(纯度81.47%)。

图7 葛花异黄酮洗脱曲线Figure 7 The elution graph of Puerariae flosisoflavones

2.2 葛花异黄酮对胰脂肪酶活性的影响

由图8可知，随葛花异黄酮浓度的增加，胰脂肪酶抑制率呈线性增加的趋势，当质量浓度超过0.2 mg/mL后，趋于平缓，在1.0 mg/mL处抑制率出现最大值40.73%，略低于奥利司他(44.36%)，但高于未精制葛花异黄酮26.65%，高于相同质量浓度的陈年乌龙茶[20]。胰脂肪酶是膳食脂肪分解的关键酶，抑制其活性可减少脂肪吸收，降低脂肪利用率[21]。葛花异黄酮可抑制胰脂肪酶活性，通过减少脂肪消化分解发挥降脂减肥作用。

图8 葛花异黄酮对胰脂肪酶活性的影响

2.3 葛花异黄酮对胆固醇酯酶活性的影响

由图9可知，随葛花异黄酮质量浓度的增大，胆固醇酯酶活性表现出一定的抑制作用，抑制率呈线性增加趋势，当质量浓度高于0.6 mg/mL时，增长趋势趋于平缓，当质量浓度为1.0 mg/mL时，抑制率最高为52.32%，略低于奥利司他(54.28%)，但高于未精制葛花异黄酮(47.46%)。抑制胆固醇酯酶活性，可减少膳食中的胆固醇酯分解成胆固醇，进而抑制胆固醇的吸收，发挥降脂减肥的作用[22]。葛花异黄酮可抑制膳食胆固醇酯分解成游离胆固醇进入消化系统，具有一定的降脂减肥活性。

图9 葛花异黄酮对胆固醇酯酶活性的影响

2.4 葛花异黄酮对胆固醇胶束溶解度的影响

由图10可知，随葛花异黄酮质量浓度的增加，胆固醇胶束溶解度抑制率呈线性增加的趋势，在质量浓度1.0 mg/mL 处，抑制率出现最大值46.17%，略低于奥利司他(48.41%)，但高于未精制葛花异黄酮(37.53%)，胆固醇胶束溶解度抑制率高于亚麻籽肽[23]。胆固醇需借助胆固醇胶束完成转运到消化系统的过程，溶解度越高，吸收利用率就越高[24]。葛花异黄酮可降低胆固醇胶束溶解度，降低胆固醇的生物利用率，发挥降脂减肥作用。

图10 葛花异黄酮对胆固醇胶束溶解度的影响

3 结论

试验优化了葛花异黄酮的精制工艺条件，同时评价其体外降脂减肥活性。葛花异黄酮精制的最优树脂选择HPD-100型大孔吸附树，精制工艺条件如下，吸附条件：上样100 mg/mL葛花异黄酮溶液(pH 6.0) 20 mL；解吸条件：利用70%乙醇溶液(pH 5.0)以2.0 mL/min的流速进行洗脱，葛花异黄酮经精制后纯度可达81.47%。精制后的葛花异黄酮在体外对胰脂肪酶、胆固醇酯酶和胆固醇胶束溶解度都表现出较好的抑制作用，并呈一定的剂量效应关系，但抑制率略低于奥利司他，高于未精制葛花异黄酮。葛花异黄酮可以通过抑制胰脂肪酶，抑制胆固醇酯酶的活性，降低胆固醇胶束溶解度，阻止食物中脂肪消化吸收而发挥降脂减肥作用，但能否在动物体内经消化后也表现出相同的降脂减肥活性，以及其作用机制将在后续研究中进行探讨。