内质网应激前列腺癌细胞通过STAT3信号途径促进巨噬细胞M2极化的研究

毛新志，童宏方，戴和平，淡彬志，朱 梅

（安徽医科大学附属巢湖医院检验科，安徽 巢湖 238000）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是美国男性癌症死亡相关的第2 大原因[1]。早期的前列腺癌是一种局限性疾病，可以采用手术或者放射性治疗[2]，而晚期的前列腺癌可以出现肝、肺和骨转移，这是导致患者死亡的主要原因[3]。目前，现有的前列腺癌治疗方法尚未有较大突破，因此，迫切需要寻找一种有效的前列腺癌治疗方法。肿瘤的生长依赖于肿瘤微环境（TME），快速生长的肿瘤导致肿瘤微环境改变，引起肿瘤细胞产生内质网应激（ERS）[4]。研究表明[5]，ERS 可在各种肿瘤中被激活，且与肿瘤的发生和发展密切相关。巨噬细胞是一种高度可塑性细胞，可被所处环境激活为抗肿瘤活性的M1 型或促肿瘤活性M2 型巨噬细胞，在肿瘤微环境中主要表现为M2 型巨噬细胞[6]。有报道显示[7]，发生ERS 的肿瘤细胞可以使巨噬细胞发生表型的转变，表明ERS 与肿瘤微环境中巨噬细胞的极化有关系，但其相关机制尚不清楚。外泌体是直径在30～150 nm 的分泌型囊泡，可被多种细胞分泌，其内含多种遗传物质。肿瘤来源的外泌体可以使微环境中的巨噬细胞发生免疫表型和免疫功能的改变，进而有利于肿瘤免疫逃逸，但外泌体通过何种途径对巨噬细胞产生影响目前尚不清楚[8]。信号转录和转录激活因子（STAT）蛋白是一个细胞质转录因子家族，其中的STAT3 参与许多生物学过程，可以被激活（通常为磷酸化），通过质膜上的受体将转录信号传递到细胞核[9]。有研究表明[10]，STAT3 信号通路在诱导THP-1 巨噬细胞M2 极化过程中发挥巨大作用，通过抑制STAT3 信号通路，可以恢复对肿瘤的免疫监测。本研究旨在探讨内质网应激前列腺癌细胞分泌的外泌体，能否通过上调巨噬细胞的STAT3 通路蛋白，进而改变巨噬细胞的免疫表型，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂 前列腺癌细胞（PC3）和人单核细胞白血病细胞（THP-1）均购于中科院上海细胞库；DMEM培养基（以色列Biological industries 公司）；RPMI 1640 培养基（美国Gibco 公司）；胎牛血清（加拿大Wisent 公司）；外泌体提取试剂盒（Exo－Quick-TC）、无外泌体胎牛血清、CD63 单克隆抗体均购于美国SBI 公司；DAPI 染核液、PKH67 绿色荧光细胞膜标记试剂盒、佛波酯（PMA）、毒胡萝卜素（TG）均购于美国Sigma 公司；兔抗GRP78（美国Bioworld 公司）；鼠抗TSG101 单克隆抗体（英国Abcam 公司）；兔抗PD-L1（美国ABclonal 公司）；兔抗Calnexin 单克隆抗体、兔抗Phospho-Stat3 抗体、兔抗Stat3 抗体均购于美国Cell Signaling Technology公司；鼠抗GAPDH 单克隆抗体、羊抗兔IgG（HRP）抗体、羊抗鼠IgG（HRP）抗体均购于武汉三鹰生物技术公司。

1.2 主要仪器和设备 无菌细胞操作台购于苏净安泰公司；电泳仪、垂直电泳槽购于北京六一仪器厂；Image Quant LAS 4000 发光成像系统购自美国GE公司；荧光显微镜购自日本Olympus 公司；激光共聚焦显微镜购自德国徕卡公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及分组 PC3 细胞以DMEM（高糖）完全培养基（10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素）、THP-1 细胞以RPMI1640 完全培养基（10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素）于饱和湿度37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每48 h 换液1 次，待细胞长至80%～90%时，对细胞进行传代。将培养完成的PC3细胞以有无TG 刺激分为空白对照组（Con 组）和TG 刺激组（TG 组）。

1.3.2 巨噬细胞的诱导及分组实验 所用巨噬细胞以50 ng/ml 浓度的PMA 诱导48 h 获得。将诱导完成的巨噬细胞根据加入不同的外泌体刺激进行分组，分为Con 组PC3 细胞外泌体刺激组（M-Con 组）与TG 组PC3 细胞外泌体刺激组（M-TG 组）。

1.3.3 蛋白印迹实验 取对数生长期的PC3 细胞或者THP-1 细胞，接种到6 孔板中，待细胞贴壁后，根据不同实验目的分别进行处理：①以不同浓度（0、1、2、2.5、3、4 μmol/L）TG 刺激PC3 细胞24 h，后用3 μmol/L 浓度TG 以不同时间（0、6、12、24、48 h）刺激PC3 细胞，观察PC3 细胞GRP78 蛋白表达情况，确定TG 最佳刺激浓度与时间；②培养Con 组PC3细胞和TG 组PC3 细胞及其分泌的外泌体，观察PC3细胞及其分泌外泌体中CD63、TSG101 与Calnexin 蛋白表达情况；③以不同浓度（10、20、30、40 μg/ml）外泌体刺激巨噬细胞24 h，后用30 μg/ml 浓度外泌体以不同时间（0、6、12、24、48 h）刺激巨噬细胞，观察巨噬细胞PD-L1 蛋白表达情况，确定外泌体最佳刺激浓度与时间；④培养M-Con 组和M-TG 组巨噬细胞，检测巨噬细胞P-STAT3 和STAT3 蛋白表达情况。收集各组细胞，提取各组细胞蛋白，用BCA 试剂盒进行蛋白定量，后加入5x 蛋白上样缓冲液，配制SDS-PAGE 凝胶，各孔中等量蛋白上样，经电泳分离、转膜等步骤后将蛋白转至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，洗膜后分别与相应一抗（GRP78抗体1∶3000 稀释；CD63 抗体、TSG101 抗体、Calnexin 抗体、PD-L1 抗体、P-STAT3 抗体、STAT3 抗体稀释比例均为1∶1000；GAPDH 抗体1∶20000 稀释）孵育过夜，经洗膜3 遍、二抗室温孵育1 h、洗膜3 遍后，发光成像系统显影。

1.3.4 外泌体的提取 分别收集Con 组和TG 组PC3细胞的培养上清，3000xg 离心15 min 去除细胞碎片，吸取上清于新的离心管中，分别加入外泌体提取试剂（ExoQuick-TC），提取Con 组分泌外泌体（Exo-Con）和TG 组细胞分泌外泌体（Exo-TG），后续进行透射电镜和蛋白印迹实验对两组外泌体进行鉴定。

1.3.5 透射电镜观察外泌体 将制备好的外泌体从-80 ℃冰箱取出，冰上自然解冻；取10 μl 于铜网正面，磷钨酸复染1～2 min，自然晾干，PBS 冲洗3 遍，自然晾干后透射电子显微镜观察外泌体的形态。

1.3.6 激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞 对外泌体的摄取用PKH67 按照试剂说明书标记PC3 细胞分泌的外泌体，加入诱导后的THP-1 细胞培养皿中，于饱和湿度、5% CO2、37 ℃恒温培养箱中共培养12 h，用预冷的PBS 洗细胞3 次，4%多聚甲醛固定30 min，弃甲醛后PBS 再次洗3 遍，后0.2% Triton-100 破膜10 min，再次PBS 洗细胞3 次，血清封闭30 min，再次PBS 洗3 遍，DAPI 染核5 min，PBS 洗3 遍后激光共聚焦显微镜观察。

1.3.7 化学发光法检测细胞炎症因子 用外泌体和诱导后的巨噬细胞共培养，取其上清液利用化学发光方法检测Exo-con 和Exo-TG 对巨噬细胞IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α 表达水平的影响。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 5.0 软件进行分析，计量数据采用（）表示，两组间比较采用配对t检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义，P＜0.01 表示统计学意义显著。

2 结果

2.1 毒胡萝卜素诱导PC3 细胞内质网应激结果 TG可刺激PC3 细胞增加GRP78 蛋白表达，且PC3 细胞分泌ERS 标志蛋白GRP78 可呈浓度依赖性（图1A，1B）和时间依赖（图1C，1D）表达增加，当浓度为3 μmol/L 时，GRP78 分泌量达最大（P＜0.05），见表1；而12 h 时与24 h 时GRP78 分泌量增加不明显（P=0.051），见表2。

图1 毒胡萝卜素诱导PC3 细胞内质网应激

表1 各组浓度相对比较（）

表1 各组浓度相对比较（）

注：与3 μmol/L 组比较

表2 各组时间相对比较（）

表2 各组时间相对比较（）

注：与24 h 组比较

2.2 外泌体的鉴定及巨噬细胞对外泌体的摄取 透射电子显微镜观察可见Exo-Con 和Exo-TG 均为双层膜样结构、圆形或类圆形小囊泡，直径为30～120 nm，大小均一散分布，符合文献报道外泌体典型特点，见图2A、2B；Western blot 结果显示，提取的Exo-Con 中和Exo-TG 中均表达CD63 和TSG101外泌体标志蛋白，且无内质网分子蛋白Calnexin 的表达，见图2E；另外，Con 组与TG 组PC3 细胞中CD63、TSG101 和Calnexin 蛋白升高表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图2C、图2D、表3；而与Exo-Con 比 较，Exo-TG 中 标 志 性 蛋 白CD63 和TSG101 的含量较高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2E、图2F、表4；激光共聚焦观察结果显示，DAPI 染核后的巨噬细胞能够摄取PKH67 标记的外泌体，见图2G。

表3 两组PC3 中Calnexin、TSG101、CD63相对表达量比较（）

表3 两组PC3 中Calnexin、TSG101、CD63相对表达量比较（）

表4 两组外泌体中TSG101 与CD63相对表达量比较（）

表4 两组外泌体中TSG101 与CD63相对表达量比较（）

图2 外泌体的鉴定与巨噬细胞对外泌体的摄取

2.3 Exo-TG 上调巨噬细胞PD-L1 表达 Western blot 结果显示，Exo-TG 可呈浓度依赖性（图3A）和时间依赖性（图3B）增加巨噬细胞PD-L1 的表达。且当Exo-TG 刺激浓度为30 μg/ml，刺激时间为24 h时巨噬细胞PD-L1 分泌量达到最大，见图3C、图3D；M-Con 组刺激浓度20、30 和40 μg/ml，M-TG组刺激浓度30、40 μg/ml，刺激12 h 和24 h 巨噬细胞PD-L1 表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表5、表6；此外，与M-Con 组比较，M-TG 组能够较明显的增加巨噬细胞分泌PD-L1 蛋白（P＜0.05），见表7。

表5 不同浓度比较（）

表5 不同浓度比较（）

注：各组均与30 μg/ml 组比较

表6 各组时间比较（）

表6 各组时间比较（）

表7 两组巨噬细胞PD-L1 相对表达量比较（）

表7 两组巨噬细胞PD-L1 相对表达量比较（）

图3 外泌体对巨噬细胞PD-L1 表达量的影响

2.4 Exo-TG 可促进巨噬细胞向M2 表型转化 化学发光结果显示，与M-Con 组相比，M-TG 组不仅能够明显升高炎症细胞因子IL-1β 和TNF-α 的浓度水平，还能够提高IL-10 表达（P＜0.05），但IL-6 浓度水平升高不明显（P＞0.05），见图4A、表8、表9。

表8 化学发光检测IL-1β、IL-6、IL-10 与TNF-α 浓度水平（，pg/ml）

表8 化学发光检测IL-1β、IL-6、IL-10 与TNF-α 浓度水平（，pg/ml）

表9 两组巨噬细胞炎症因子水平相对表达量（）

表9 两组巨噬细胞炎症因子水平相对表达量（）

图4 化学发光法检测巨噬细胞炎症因子

2.5 Exo-TG 可上调巨噬细胞P-STAT3 的表达Western blot 结果显示，与M-Con 组相比，M-TG 组中的STAT3 蛋白升高不明显（P＞0.05），而P-STAT3蛋白升高（P＜0.05），见图5A，且P-STAT3/STAT3 的比值升高（P＜0.05），见图5B、表10。

图5 外泌体对巨噬细胞STAT3 表达的影响

表10 两组巨噬细胞STAT3 通路蛋白相对表达量比较（）

表10 两组巨噬细胞STAT3 通路蛋白相对表达量比较（）

3 讨论

由于肿瘤细胞的快速生长，可引发肿瘤微环境发生改变，如组织缺氧、营养不足、低pH 等，进而诱发肿瘤产生内质网应激，内质网应激已被证明在调节血管生成、炎症、侵袭转移和化疗耐药性中发挥重要作用[11]。外泌体是含有多种遗传信息的载体，在肿瘤细胞和免疫细胞信息传递中发挥重要作用，可以介导巨噬细胞的分化，最终促进肿瘤的发展[12，13]。在肿瘤微环境中大多以M2 型巨噬细胞为主，且M2 巨噬细胞对肿瘤的进展及预后均有消极影响。有研究表明[14]，乳腺癌细胞来源的外泌体可以促进巨噬细胞向M2 表型转化，促进乳腺癌的免疫逃逸。因此，内质网应激前列腺癌细胞也可能通过外泌体促进巨噬细胞M2 表型极化，具体机制仍需进一步研究。

葡萄糖调节蛋白（GRP78）存在于所有真核生物内质网膜上，在内质网应激情况下，GRP78 的表达增加[15]。本研究用TG 刺激前列腺癌细胞构建前列腺癌ERS 模型，结果表明，TG 能够引起内质网应激蛋白GRP78 表达增加，且当以3 μmol/L 毒胡萝卜素刺激前列腺癌细胞24 h 时，GRP78 蛋白表达量最高，这时能够较好的构建前列腺癌ERS 模型。研究还发现，ERS 的前列腺癌细胞能够分泌外泌体，并且ERS 的外泌体能够表达更多的CD63 与TSG101，这表明ERS 可能致使外泌体携带更多的遗传物质。目前巨噬细胞亚型可分为经典活化促炎M1 型和替代活化M2 型。根据相关文献报道[16]，M2型巨噬细胞不仅能表达促炎因子IL-1β、IL-6 和TNF-α，还高表达抗炎因子IL-10 和低水平的IL-12。在本研究中，内质网应激的PC3 细胞释放的外泌体能够被巨噬细胞所摄取，并分泌大量IL-1β、IL-10和TNF-α 细胞炎症因子，说明内质网应激PC3 细胞外泌体能够促进巨噬细胞向M2 表型极化；但IL-6 的分泌增加不明显，这可能与内质网应激前列腺癌细胞外泌体同时促进巨噬细胞向M1 型M2 型的混合极化，这在黑色素瘤细胞中有相关报道[17]。肿瘤相关巨噬细胞的极化并不是一个静态的，近年来，有研究发现通过调节NF-κB 通路能够促进巨噬细胞M1 极化，抑制M2 极化[18]。在胰腺癌模型中，PI3K-γ 通路和CSF-1/CSF1R 的双重阻断可使M2型巨噬细胞转变为M1 型巨噬细胞[19]。以上相关文献说明巨噬细胞是可以被动态调控的，但具体相关机制有待进一步研究。本研究还发现，除了改变巨噬细胞免疫表型，高表达炎症因子外，巨噬细胞中PD-L1 蛋白也被上调。而PD-L1 的上调又被证明能够抑制CD8+T 细胞的细胞毒性，促进肿瘤免疫逃逸[20]。综上所述，M2 极化巨噬细胞与肿瘤免疫密切相关，可以与抗肿瘤治疗相联系，作为辅助治疗的潜在靶点。

STAT3 可在多种癌症中被激活。有研究报道[21]，乳腺癌细胞来源的乳酸通过激活ERK/STAT3 信号通路诱导乳腺癌M2 巨噬细胞极化，从而促进乳腺癌进展。还有研究表明，乳腺癌细胞来源的外泌体通过gp130 通过激活巨噬细胞IL-6/STAT3 信号通路，诱导促肿瘤细胞因子的表达，从而使骨髓源性巨噬细胞向促肿瘤生长的M2 型巨噬细胞转化[22]。以上研究表明，STAT3 在巨噬细胞M2 极化中发挥重要作用。在本研究中，来自内质网应激PC3 细胞的外泌体能够使巨噬细胞STAT3 蛋白明显磷酸化，而STAT3 蛋白表达升高不明显，说明ERS 前列腺癌细胞外泌体可激活巨噬细胞STAT3 磷酸化蛋白通路，引起巨噬细胞向M2 型分化，并引起IL-1β、IL-10和TNF-α 的分泌增加和PD-L1 蛋白表达，从而发挥抗肿瘤免疫的功能，这与既往的研究[23]相符合。有研究表明[24]，在肺癌中，薯蓣皂苷可能作为一种潜在的IL-10 抑制剂，通过下调活化STAT3 的表达，抑制巨噬细胞M2 极化从而诱导抗肿瘤免疫。同样的，在前列腺癌中，已有研究证明let-7b-5p 可以通过调节SOCS1/STAT 通路的活性来调节M1/M2 转换，最终影响前列腺癌增殖[25]；这说明STAT3 是一个新的可控的调节位点，在未来有望成为一个新的治疗靶点。

综上所述，内质网应激的前列腺癌细胞能够借助外泌体将应激信号传递给THP-1 巨噬细胞，引起巨噬细胞STAT3 的磷酸化，上调巨噬细胞PD-L1的表达，引起巨噬细胞M2 表型转化，并分泌大量IL-1β、IL-10 和TNF-α 细胞炎症因子，促进前列腺癌细胞的免疫逃逸，具体机制还要进一步研究。尽管仅限于体外模型，但这些结果证明了外泌体能够在肿瘤细胞和免疫细胞中传递信息，并改变巨噬细胞免疫表型，促进癌症的进展，也为治疗前列腺癌提供了理论依据。