化痰除湿汤对衰老大鼠胸腺皮质超微结构和氧化损伤的影响

张丽芬，田曜恺

(1北京中医药大学第三附属医院肾病科,北京 100029;2广州中医药大学第二临床医学院,广州510006)

衰老是一个不可避免的自然规律，然而衰老的过程是可以延缓的。正如《黄帝内经》中上古名医歧伯与黄帝在对话中说“夫道者能却老而全形，身年虽寿，能生子也。”“上古有真人者，提挈天地，把握阴阳，呼吸精气，独立守神，肌肉若一，故能寿敝天地，无有终时。”指出得道和达到真人的境界可以却老，可以寿敝天地[1]。现代医学认为，抗氧化和增强机体免疫功能是抗衰老和治疗衰老性疾病的有效方法。中医药化痰除湿法在临床上应用广泛，在治疗糖尿病、肾脏病、脾胃病、血管痴呆、心脑血管病、高脂血症及动脉硬化等多种老年性疾病中配合化痰除湿中药疗效良好，但其作用机制未明。本实验以D-半乳糖复制经典大鼠衰老模型，观察化痰除湿汤干预后衰老大鼠血清总抗氧化力(total antioxidation capacity,T-AOC)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、脂质过氧化物(lipid peroxide,LPO)和胸腺皮质内上皮细胞和淋巴细胞的超微结构，探讨化痰除湿汤抗衰老分子机制。

1 材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1 动物 健康纯种Wistar大鼠40只，一级动物，雌雄各20只，体质量130～170 g，购自天津药物研究院动物室(动物生产合格证号：98004)。

1.1.2 药物制备与试剂 (1)化痰除湿汤：由陈皮、半夏、茯苓及苍术等组成(由天津中医药大学门诊部药剂科提供并鉴定)。生药先以7倍量蒸馏水浸泡2 h后煎煮40 min取滤液，再加5倍量的冷蒸馏水煎煮30 min取滤液，合并2次药液浓缩至生药含量为2 g/ml，4 ℃冰箱保存备用。(2)维生素E胶丸(天津市中央制药二厂出品，批号：981210)：用针刺破胶丸,挤出维生素E(vitamin E，VitE),用称量瓶取6 g,加入吐温-80 1.2 g，搅拌均匀，然后逐次加入适量蒸馏水并搅拌均匀，使之成为乳状，最后稀释至200 ml(含吐温-80为0.6%)。(3)D-半乳糖(批号：980922，上海试剂二厂)：用生理盐水配成制成5%溶液备用。T-AOC试剂盒由英国Randox公司提供；LPO检测试剂盒和LDH检测试剂盒均由上海长征公司提供。

1.1.3 仪器 754分光光度计、960MC荧光分光光度计和离心机均由上海第三分析仪器厂生产；Opera全自动生化分析仪由德国Bayer公司生产；Philips EM 400ST电镜由天津南开大学电镜室提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及分组给药 衰老大鼠模型制备参照《抗衰老研究实验方法》[2]。40只一级Wistar大鼠适应性普通饲料喂养1周后，随机取30只大鼠每日颈背皮下注射D-半乳糖溶液48 mg/kg，连续注射40 d。余10只作为正常对照组，每日颈背皮下注射等体积的生理盐水。造模组大鼠随机分为衰老组、化痰除湿组及阳性对照组。于造模第1天起，化痰除湿组每日灌胃化痰除湿汤水煎剂20 g/(kg·d)，阳性对照组每日灌胃维生素E溶液0.3 g/(kg·d)，衰老组和正常对照组每日灌胃等体积蒸馏水。体质量增长率=(体质量41 d-体质量0 d)/体质量0 d。

1.2.2 血液标本采集和血清制备 实验第41天，股动脉取血1.5 ml,离心取血清，-70 ℃冻存待检。

1.2.3 血清T-AOC、LDH、LPO检测 血清T-AOC用英国Randox公司试剂盒(Control No.NX2331，Lot No.091 NX)检测,原理为以固体过氧化物为底物，在变性肌球蛋白(metamyoglobin)的触酶作用下，生成新生态氧，与2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐作用生成蓝绿色；测定A600 nm。在加入标本时，血浆的抗氧化力可阻抑此反应，使呈色减弱。血清LDH应用酶动力法，用Bayer公司Opera全自动生化分析仪检测；血清LPO应用硫代巴比妥酸比色定量法检测。

1.2.4 胸腺皮质电镜标本取材和制备 大鼠颈椎脱臼法处死后，迅速剪开胸腔，取胸腺皮质切成1 mm×1 mm×1 mm小块固定于2% 戊二醛固定液中，反复洗涤后用1%锇酸溶液作后固定，酒精系列脱水，环氧树脂包埋。LKB-V型超薄切片机切片，醋酸铀与柠檬酸铅双重染色，作电镜观察摄片。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状态观察

正常对照组大鼠毛色白而有光泽、耳色红润、活动灵敏、精神状态佳、食量及饮水量正常。衰老组大鼠毛色渐趋枯槁，没有光泽、易脱落、精神萎靡、倦怠嗜睡、群体喜扎堆及进食量减少；2个治疗组大鼠上述表现较衰老模型组好转。

2.2 化痰除湿汤对衰老大鼠体质量的影响

实验0、14、28、41 d称取每只大鼠体质量,结果显示，实验前各组大鼠体质量比较，差异均无统计学意义(均P>0.05);实验14、28、41 d各组大鼠体质量均有明显增长，化痰除湿组体质量增长率较其他3组略低，但各组间比较，差异均无统计学意义(均P>0.05；表1)。

2.3 化痰除湿汤对衰老大鼠血清T-AOC、LDH及LOP水平影响

治疗第41天，与正常对照组比较，衰老组大鼠血清T-AOC水平显著降低，血清LDH、LPO水平显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.01)。与衰老组比较，化痰除湿组和阳性对照组血清T-AOC水平均升高，血清LDH水平显著下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)；化痰除湿组血清LPO水平显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)；阳性对照组血清LPO水平也有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。与阳性对照组比较，化痰除湿组血清T-AOC水平显著较高，血清LPO水平显著较低，差异均有统计学意义(均P<0.01)；2治疗组血清LDH比较，差异无统计学意义(P>0.05；表2)。

表2 化痰除湿汤对衰老大鼠血清T-AOC、LHD及LPO影响

2.4 化痰除湿汤对衰老模型大鼠胸腺皮质超微结构的影响

2.4.1 正常对照组 胸腺皮质上皮细胞形体大，多突起，细胞核较大，沿核周边有薄层异染色质，分布均匀；胞质内线粒体丰富而完整，粗面内质网也较发达(图1A)；胸腺皮质可见较多的淋巴细胞，细胞连接紧密，几乎没有间隙，淋巴细胞呈圆形或椭圆形，细胞核大，约为细胞体积的4/5，细胞核居中，染色质分布均匀，核仁清楚；胞质少，胞质内可见线粒体和内质网丰富(图2A)。

图1 电子显微镜观察各组大鼠胸腺上皮细胞Figure 1 Thymus epithelial cells of all groups under electromicroscopeA: normal control group(×7 000); B: aging group(×7 000); C: decoction group(×7 000); D: positive control group(×14 500).

2.4.2 衰老组 胸腺皮质上皮细胞核膜间隙扩张，细胞核固缩变形，核内电子致密物增多，核染色质呈斑块状和条索状凝集。胞质内线粒体、内质网等细胞器减少，溶酶体增多，细胞边界不清(图1B)。胸腺皮质淋巴细胞数量减少，细胞间隙明显增大，正常连接受损。细胞核固缩，核膜间隙增大，可见凋亡细胞胞体皱缩和电子密度较高的凋亡小体存在；胞质内线粒体、内质网等细胞器减少(图2B)。

2.4.3 化痰除湿组 胸腺皮质上皮细胞核形态基本正常，核染色质凝集，核膜间隙增大，线粒体结构基本完整,周围可见形态基本正常的淋巴细胞(图1C)；胸腺皮质淋巴细胞损伤较模型组减轻，淋巴细胞数量较模型组增多，胞质内线粒体等细胞器较模型组丰富(图2C)。

图2 电子显微镜观察各组大鼠胸腺淋巴细胞Figure 2 Thymus lymphocytes of all groups under electromicroscope(×7 000)A: control group; B: aging group; C: decoction group; D: positive control group.

2.4.4 阳性对照组 胸腺皮质上皮细胞核染色质呈斑块状分布不均匀，核内电子致密物增多；胞浆内可见线粒体，但线粒体肿胀，空泡化，胞浆空泡化(图1D)。胸腺皮质淋巴细胞损伤较模型组减轻，淋巴细胞数量较模型组增多，胞质内线粒体等细胞器较模型组丰富。细胞形态不规则，可见凋亡小体、溶酶体和脂褐素(图2D)。

3 讨 论

衰老是肿瘤、动脉粥样硬化性心血管病、血管性痴呆、脑卒中、高血压、慢性阻塞性肺病、糖尿病、肾脏病、血脂异常和神经功能退化疾病等疾病的独立危险因素[3，4]。中医在防治衰老性疾病中总结了丰富的经验。《黄帝内经》十三方中，治疗内科性疾病10个方剂中有6个方剂有除湿化痰饮作用,以兰草汤、半夏汤和泽泻白术汤为代表。痰湿是冠心病、心律失常、高血压、高脂血症[5]、肿瘤[6]、慢性肾脏病[8]、痴呆[9]及慢性阻塞性肺病[10]等多种老年性疾病的主要病机和证型。故有“百病都由痰作祟”之说。可见痰湿致病的广泛性和古人祛病延年重视除痰湿的治疗思想。化痰除湿汤是由二陈汤和平胃散化裁而来,二陈汤和平胃散均来源北宋神宗元丰年间(1078-1085)成书的《太平惠民和剂局方》，可以调脾胃，化宿食，消痰饮，除寒、湿、风、冷[11]。临床用于治疗痰饮湿浊引起的多种慢性病和老年性疾病有良好疗效。

本研究中体质量指标显示化痰除湿组大鼠体质量及体质量增长率低于其他3组,与既往研究相符合[12,13],认为化痰除湿汤可能有治疗肥胖作用。

T-AOC代表体内酶性和非酶性抗氧化物的总水平，可直接反应机体抗氧化能力[14]。LDH存在于机体所有组织细胞的胞质内，随着细胞的破坏、细胞膜通透性增加可释放入血。细胞受损和机体缺血缺氧越重LDH越高[15]。LDH是机体病理损伤、炎症反应和氧化应激的标志。因此，血液中的LDH水平常常作为炎症[16]、肿瘤[17]、糖尿病[18]、高血压[19]、心肌缺血[20]、心力衰竭[21]及肺血栓栓塞[22]等疾病的严重程度预测指标，也可以作为疲劳的检测指标[23]。LPO是人体内多聚不饱和脂肪酸和氧自由基结合后的产物，LPO水平升高，可以引起细胞内的蛋白质、核酸、糖类和脂类过氧化，使细胞结构出现不可逆转的改变，最终造成免疫功能失调、蛋白质变性及血栓形成等，与人体疾病如冠心病、心肌梗死、肝硬化、肝癌、肺心病、支气管哮喘、阿尔茨海默病、帕金森氏病及慢性肾病等多种疾病均有关系。通过抗脂质氧化治疗，减少LPO水平，可以降低LPO对组织及器官的损伤[24]。维生素E的抗衰老研究开始较早，研究表明其可以抗自由基和抗氧化,并能提高人体免疫力，从而具有抗衰老作用。因此本研究中以维生素E作为阳性对照药物。在本研究中，我们发现，衰老模型大鼠血清T-AOC显著下降，而LDH和LPO明显增加。与衰老模型组比较，化痰除湿组血清T-AOC明显升高，LDH、LPO明显下降，并且在升高T-AOC和降低LPO方面优于维生素E。说明化痰除湿汤可以提高衰老大鼠抗氧化能力，减轻氧化损伤，减少脂质过氧化物的聚积，有延缓衰老作用。

机体的衰老与免疫系统功能有密切的关系，80%以上疾病与免疫失调相关[25]。免疫功能的水平,比年龄能更准确地预测寿命[26]。胸腺是免疫系统的中枢器官，与寿命相关。现代医学证明，胸腺萎缩，功能减退，机体也随之衰老，疾病丛生。胸腺内还有自然杀伤细胞，专门消灭癌细胞。增加T淋巴细胞和自然杀伤细胞，可以延缓机体衰老、祛病延年[27]。胸腺上皮细胞可以调节T细胞在胸腺内分化发育、成熟的过程，减少使自身反应性T细胞输出，从而预防自身免疫反应的发生[28]。本研究发现与正常对照组相比，衰老组胸腺皮质中上皮细胞和淋巴细胞明显减少，细胞结构明显破坏，细胞核皱缩变形，胞质内线粒体、内质网等细胞器明显减少，溶酶体增多；化痰除湿组和阳性对照组胸腺皮质中上皮细胞和淋巴细胞较衰老组增多，细胞结构较衰老组明显改善。

综上，本研究证明化痰除湿汤可显著提高机体抗氧化力，降低氧化损伤、减少脂质过氧化物，增加胸腺皮质中上皮细胞和淋巴细胞数量，保护细胞形态和线粒体超微结构。化痰除湿汤有干预性抗衰老和提高免疫作用。